マウス神経新生時のノッチシグナル伝達ダイナミクスのリアルタイム生物発光イメージング
Summary
神経幹/前駆細胞は、細胞イベントの異なる結果につながるノッチシグナル伝達成分の様々な発現ダイナミクスを示す。このような動的発現は、遺伝子発現の急速な変化の可視化を可能にする高感度生物発光イメージングシステムを用いて、静的解析ではなくリアルタイムモニタリングによって明らかにすることができる。
Abstract
ノッチシグナル伝達は、細胞間相互作用によって神経幹/前駆細胞の維持を調節する。ノッチシグナリングの成分は動的発現を示す。ノッチシグナル伝達エフェクターHes1およびノッチリガンドデルタ様1(Dll1)は、神経幹/前駆細胞において振動的に発現される。これらの遺伝子の振動発現の期間は非常に短い(2時間)ため、その周期発現を監視することは困難である。このような遺伝子発現またはタンパク質ダイナミクスの急速な変化を調べるには、迅速な応答レポーターが必要である。その速い成熟運動と高感度のために、生物発光レポータールシフェラーゼは、生きている細胞の急速な遺伝子発現変化を監視するのに適しています。プロモーター活性をモニタリングするために不安定化ルシフェラーゼレポーターと、単一細胞分解能でタンパク質ダイナミクスを可視化するためのルシフェラーゼ融合レポーターを使用しました。これらの生物発光レポーターは、急速な回転率を示し、非常に弱い信号を生成します。そこで、このようなかすかな信号を検出する高感度生物発光イメージングシステムを開発しました。これらの方法により、生きている細胞や組織における様々な遺伝子発現ダイナミクスをモニタリングすることが可能となり、実際の細胞状態を理解するのに役立つ重要な情報である。
Introduction
哺乳類の脳は、様々な種類のニューロンとグリア細胞で構成されています。すべての細胞は神経幹/前駆細胞(NPC)から生成され、最初に増殖してその数を拡大し、次にニューロンに分化し始め、最後にグリア細胞1、2、3、4、5を生み出します。細胞がニューロンに分化すると、細胞の増殖や数の増加はできないため、後の段階までNPCのメンテナンスが重要になります。細胞間相互作用を介したノッチシグナル伝達は、NPC6、7を維持する上で重要な役割を果たす。ノッチリガンドは、隣接する細胞の表面上の膜タンパク質、ノッチと相互作用し、ノッチタンパク質を活性化します。活性化後、ノッチタンパク質のタンパク質分解が起こり、それによってノッチ(NICD)の細胞内ドメインを細胞膜から核8、9、10に放出する。核では、NICDはHes1およびHes5(Hes1/5)のプロモーター領域に結合し、これらの遺伝子の発現を活性化する。 Hes1/5 は、プロニューラル遺伝子Ascl1およびニューロゲニン1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14の発現を抑制します。プロニューラル遺伝子は神経分化を誘発するので、Hes1/5はNPCの維持に重要な役割を果たします。さらに、プロニューアル遺伝子はノッチリガンドデルタ様1(Dll1)の発現を活性化することができるので、Hes1/5もDll1の発現を抑制する。したがって、Dll1 の式は、ノッチシグナリングを介して Dll1 に対して隣接するセルが負の結果になります。このようにして、細胞は隣接する細胞が同じ運命をたどるのを阻害し、横方向阻害8と呼ばれる現象である。発達中の脳では、側面阻害は様々な異なる細胞型を生成する役割を果たす。
単一細胞レベルでのリアルタイムイメージングは、NPC15、16、17におけるノッチシグナリングの成分の動的表現を明らかにする。ノッチシグナル伝達はHes1の発現を活性化しますが、Hes1タンパク質は独自のプロモーターに結合し、独自の発現を抑制します。さらに、Hes1は非常に不安定なタンパク質であり、ユビキチン-プロテアソーム経路によって分解される。したがって、独自のプロモーターの抑圧は短命であり、その後、転写が再び開始されます。このようにして、Hes1の発現は、2時間サイクル18における転写レベルと翻訳レベルの両方で振動する。Hes1の振動発現は、順番に、Ascl1、Neurog2、およびDll1などの下流標的遺伝子の振動発現を、周期的な抑制15、16、17、19を介して誘導する。プロニューラル遺伝子は神経分化を誘発する可能性がありますが、その振動発現は神経分化には不十分です。むしろ彼らの持続的な発現は、神経の分化のために不可欠です。プロエン神経遺伝子の振動発現は、神経分化14、15、16を誘導するのではなく、NPCを維持するために重要である。Dll1の発現は、神経新生やソミトジェネシスなどの様々な形態形成の間の転写および翻訳レベルの両方で振動する。Dll1の動的発現は、正常な形態形成およびDll1の安定した発現が神経新生およびソミト形成17の欠陥を誘発する上で重要である。これらの知見は、遺伝子発現およびタンパク質動態のダイナミクスが様々な発達イベントの調節に及ぼす重要な機能を示している(すなわち、異なる発現ダイナミクスが細胞挙動において異なる出力を生み出す)。
ノッチシグナル伝達のダイナミクスを分析するために、組織や細胞の静的解析は絶えず変化しているため不十分です。単一細胞のリアルタイムイメージングは、遺伝子発現のダイナミクスを明らかにする強力なツールです。ノッチシグナル伝達分子の動的発現は、2〜3時間の間に急速な環状応答を受ける。この迅速な周期的発現は、リアルタイムモニタリングのための2つの困難な問題を提示する:(1)分子の発現が低レベルに抑制され、(2)急速な回転率は高速応答レポーターを必要とする。これらの問題を克服するために、我々は以前に生物発光リアルタイムイメージング法20を開発した。生物発光レポーターは蛍光レポーターよりも感度が高く成熟時間が短いため、生細胞の急激なダイナミクスをモニタリングすることができます。リアルタイムビジュアライゼーションを用いて、これまで考えられていたよりも多くの遺伝子が動的発現を示していることがわかりました。また、生細胞における発現およびタンパク質ダイナミクスを示す報告の数および様々な生物学的事象におけるこれらのダイナミクスの意義が増加しており、遺伝子発現21、22におけるダイナミクスの基本的な役割を示唆している。
本報告では、解別培養と皮質スライス培養の両方において、NPCにおけるノッチリガンドDll1の発現を可視化する方法について説明する。単一細胞レベルでのDll1転写のダイナミクスをモニタリングするために、pDll1-Ub-Flucレポーターを担うトランスジェニックマウスの胚性脳から由来するNPCの解離培養物を生成した。生体内のDll1タンパク質ダイナミクスをモニタリングするために、皮質のNPCにDll1-Fluc融合レポーターを導入し、皮質スライス培養におけるNPCにおけるレポーターの発現を可視化した。リアルタイムイメージングにより、生細胞における遺伝子発現やタンパク質ダイナミクスの様々な特徴を高い時間分解能で捉え得ることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ノッチシグナル伝達の成分は、ソミト形成時に同期して振動発現を示すが、神経新生時には同期がとれないので、後者の場合には静的解析によって発現ダイナミクスを捕捉するのが困難になる。したがって、Hes1やDll1などのノッチ シグナリング コンポーネントの表現ダイナミクスを明らかにするには、リアルタイム監視が必要です。Hes1およびDll1振動の式の期間は?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
映像制作を応援してくださった岩本由美子さんに感謝します。また、磯村明宏の議論や画像解析のサポートにも感謝しており、トランスジェニック動物の生成に対する技術支援のための宮地仁、新庄裕司(オリンパス医学)、江川正敏(オリンパス医科)、石津拓也()オリンパス医科学)とオイン・クニタキ(アンドール・ジャパン)は、生物発光イメージングシステムの技術サポートと議論を行っています。この研究は、進化科学技術のコア研究(JPMJCR12W2)(R.K.)、革新的領域に関する科学研究のための助成(H.S.のためのMEXT 24116705およびR.K.のためのMEXT 16H06480)、科学研究のための補助金援助(C)(JSPS)によって支えられた18K06254)(H.S.)、武田財団(R.K.およびH.S.)、および文部科学省の生活システムへの動的アプローチのためのプラットフォーム。
Materials
| Bioluminescence Imaging System | |||
| Chilled water circulator (chiller) | Julabo | Model: F12-ED | |
| Cooled CCD camera | Andor Technology | Model: iKon-M 934 | |
| Incubator system | TOKAI HIT | Model: INU-ONICS | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX81 | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX83 | |
| LED illumination device | CoolLED | Model: pE1 | |
| MetaMorph | MOLECULAR DEVICES | Model: 40000 | |
| Mix gas controller | Tokken | Model: TK-MIGM OLO2 | |
| Objective lens | Olympus | Model: UPLFLN 40X O | |
| Preparations for Dissection | |||
| Dissection microscope | Nikon | Model: SMZ-2B | |
| Fluorescence stereoscopic microscope | Leica | Model: MZ16FA | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Scissors, Micro scissors | |||
| Forceps | |||
| Ring-shaped forceps | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Reagents for NPC dissociation culture | |||
| B27 supplement | invitrogen | 12587-010 | |
| bFGF | invitrogen | 13256-029 | Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS |
| D-luciferin | Nacalai Tesque | 01493-85 | Stock solution: 100mM in 0.9% saline |
| DNase | Worthington Biochemical Corporation | LK003172 | Stock solution: 1000U/ml in EBSS |
| EBSS | Worthington Biochemical Corporation | LK003188 | |
| Glass bottom dish | IWAKI | 3910-035 | |
| N2 supplement (100x) | invitrogen | 17502-048 | |
| N-acetyl-cystein | Sigma | A-9165-25G | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LK003178 | Stock solution: 7U/ml in EBSS |
| Penicillin/Streptmycine | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P-6281 | 40 mg/ml in DW |
| Preparations for in utero electroporation | |||
| 50-ml syringe | TERUMO | 181228T | |
| Electrode | Neppagene | 7-mm | |
| Electroporator | Neppagene | CUY21 EDIT | |
| Forceps | |||
| Gauzes | Kawamoto co. | 7161 | |
| Micro capillary | Made in-house | ||
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Pentbarbital | Kyoritsuseiyaku | Somnopentyl | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Suture needle | Akiyama MEDICAL MFG. CO | F17-40B2 | |
| Xylazine | Bayer | Seractal | |
| Preparations for Slice culture | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| Culture insert | Millipore | PICM01250 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012-500ML | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Forceps | |||
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Micro surgical knife | Alcon | 19 Gauge V-Lance | |
| Multi-gas incubator | Panasonic | MCO-5MUV-PJ | |
| N2/B27 media | Made in-house | ref. NPC dissociatioin culture | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Silicon rubber cutting board | Made in-house |
References
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