Real-Time bioluminesens Imaging av hakk signalering dynamikk under murine neurogenesis
Summary
Neural Stem/stamceller viser ulike uttrykk dynamikk av notch signalering komponenter som fører til ulike utfall av cellulære hendelser. Slike dynamiske uttrykk kan avsløres av sanntids overvåking, ikke av statisk analyse, ved hjelp av en svært følsom bioluminesens Imaging system som muliggjør visualisering av raske endringer i genuttrykk.
Abstract
Notch signalering regulerer vedlikehold av Neural Stem/stamceller ved celle-celle interaksjoner. Komponentene i notch signaliserer viser dynamisk uttrykk. Notch signalering effektor Hes1 og notch ligand delta-like1 (Dll1) uttrykkes på en oscillasjon måte i neural Stem/stamceller. Fordi perioden av oscillasjon uttrykk for disse genene er svært kort (2 h), er det vanskelig å overvåke deres sykliske uttrykk. For å undersøke slike raske endringer i genuttrykk eller protein dynamikk, er rask respons journalister nødvendig. På grunn av sin raske modning Kinetics og høy følsomhet, den bioluminesens reporter luciferase er egnet til å overvåke raske genuttrykk endringer i levende celler. Vi brukte en destabilisert luciferase reporter for overvåking arrangøren aktivitet og en luciferase-smeltet reporter for visualisering av protein dynamikk på én celle oppløsning. Disse bioluminesens journalistene viser rask omsetning og genererer svært svake signaler; Derfor har vi utviklet et svært følsomt bioluminesens bildesystem for å oppdage slike svake signaler. Disse metodene gjør oss i stand til å overvåke ulike genuttrykk dynamikk i levende celler og vev, som er viktig informasjon for å hjelpe forstå den faktiske cellulære stater.
Introduction
Pattedyr hjernen består av et stort antall ulike typer neurons og gliacellene celler. Alle celler er generert fra neural Stem/stamceller (NPCer), som først sprer seg for å utvide sine tall, og deretter begynne å differensiere til neurons, og til slutt gi opphav til gliacellene celler1,2,3,4,5. Når cellene har differensiert inn i neurons, kan de ikke sprer eller øke sine tall, og derfor vedlikehold av NPCer til senere stadier er viktig. Hakk signalering via celle-celle interaksjoner spiller en viktig rolle i å opprettholde NPCer6,7. Notch ligander samhandle med membran protein, notch, på overflaten av nærliggende celler og aktiverer notch protein. Etter aktivering, proteinolyse av hakk protein oppstår, og dermed slippe intracellulære domene av hakk (NICD) fra cellemembranen i kjernen8,9,10. I kjernen, binder NICD til arrangøren regionene Hes1 og Hes5 (Hes1/5) og aktiverer uttrykk for disse genene. Hes1/5 undertrykke uttrykk for proneural gener Ascl1 og Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. Fordi proneural gener induserer neuronal differensiering, Hes1/5 spille viktige roller i å opprettholde NPCer. Videre, som proneural gener kan aktivere uttrykket av notch ligand delta-like1 (Dll1), Hes1/5 også undertrykke uttrykk for Dll1. Derfor, uttrykk for Dll1 fører til nærliggende celler blir negativt for Dll1 via notch signalering. På denne måten cellene hemme tilstøtende celler fra å følge deres samme skjebne, et fenomen som kalles lateral hemming8. I den utviklende hjernen, lateral hemming spiller en rolle i å generere ulike celletyper.
Real-Time Imaging på enkelt cellenivå avslører dynamiske uttrykk for komponentene i hakk signalering i NPCer15,16,17. Notch signalering aktiverer uttrykk for Hes1, men Hes1 protein binder seg til sin egen promoter og fortrenger sitt eget uttrykk. Videre er Hes1 en ekstremt ustabil protein, som er degradert av ubiquitin-proteasomet veien; Derfor er undertrykkelse av sin egen promoter bare kortvarig og deretter transkripsjon starter igjen. På denne måten uttrykket av Hes1 svinger på både transkripsjon og translational nivåer i en 2 h syklus18. Den oscillasjon uttrykk for Hes1, i sin tur induserer oscillasjon uttrykk for nedstrøms mål gener, for eksempel Ascl1, Neurog2, og Dll1, via periodisk undertrykkelse15,16,17,19. Mens proneural gener kan indusere neuronal differensiering, er deres oscillasjon uttrykk ikke tilstrekkelig for neuronal differensiering; snarere deres vedvarende uttrykk er avgjørende for neuronal differensiering. Den oscillasjon uttrykk for proneural gener er viktig for å opprettholde NPCer snarere enn for inducing neuronal differensiering14,15,16. Uttrykket av Dll1 svinger på både transkripsjon og translational nivåer under ulike morphogenesis, slik som neurogenesis og somitogenesis. Den dynamiske uttrykk for Dll1 er viktig for normal morphogenesis og jevn uttrykk for Dll1 medfører defekter i neurogenesis og somitogenesis17. Disse funnene viser den viktige funksjonen som dynamikken i genet uttrykk og protein Kinetics har på regulering av ulike utviklingsmessige hendelser (dvs. ulike uttrykk dynamikk produsere ulike utganger i cellulære atferd).
Å analysere dynamikken i notch signalering, den statiske analyse av vev og celler er utilstrekkelig fordi de er i stadig endring. Real-Time Imaging av enkeltceller er et kraftig verktøy for å avdekke dynamikken i genet uttrykk. Den dynamiske uttrykk for notch signalering molekyler gjennomgår rask syklisk svar i perioden 2-3 h. Dette raske periodiske uttrykket presenterer to vanskelige problemer for sanntids overvåking: (1) uttrykket av molekylene er undertrykt til lave nivåer, og (2) rask omsetning krever rask respons journalister. For å overkomme disse problemene, har vi tidligere utviklet en bioluminesens sann tids avbildnings metode20. Fordi bioluminesens reporteren har en høyere følsomhet og kortere modningstid enn fluorescerende journalister, gjør denne strategien oss til å overvåke den raske dynamikken i levende celler. Ved hjelp av sanntids visualisering, fant vi ut at flere gener utstilt dynamiske uttrykk enn vi tidligere hadde trodd. I tillegg har antall rapporter som viser uttrykk og protein dynamikk i levende celler og betydningen av disse dynamikken i ulike biologiske hendelser økt, noe som tyder på en fundamental rolle av dynamikken i genuttrykk21,22.
I denne rapporten beskriver vi en måte å visualisere uttrykket av notch ligand Dll1 i NPCer i både dissosiert kulturer og i kortikale Slice kulturer. For å overvåke dynamikken i Dll1 transkripsjon på enkelt celle nivåer, genererte vi dissosiert kulturer av NPCer avledet fra den embryonale Telencephalon av transgene mus bærer PDll1-UB-svingninger reporter, en Dll1 promoter-drevet destabilisert luciferase reporter. For å overvåke Dll1 protein dynamikk in vivo introduserte vi Dll1-svingninger fusjons reporter til NPCer i cortex og visualisere uttrykket av reporteren i NPCer i kortikale skive kulturer. Real-Time Imaging aktivert oss å fange de ulike funksjonene i genuttrykk og protein dynamikk i levende celler ved høy Temporal oppløsning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Komponentene i notch signalering viser oscillasjon uttrykk i Synchrony under somitogenesis men ut av Synchrony under neurogenesis, fører til vanskeligheter i å fange uttrykket dynamikk ved statisk analyse i sistnevnte tilfelle. Således, virkelig-tid avlytting er krevde å avsløre uttrykket dynamikken av hakk signalering komponentene, som Hes1 og Dll1. Fordi periodene i uttrykkene for Hes1 og Dll1 svingninger er ekstremt korte, er omtrent 2-3 h, rask respons og ustabile journalister…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Yumiko Iwamoto for å støtte produksjonen av videoen. Vi er også takknemlige for Akihiro Isomura for diskusjon og støtte av bildeanalyse, Hitoshi Bramidan for teknisk støtte for generering av transgene dyr, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Sangchul Egawa (Olympus Medical Science), Takuya Ishizu ( Olympus Medical Science) og Ouin Kunitaki (Andor Japan) for teknisk støtte og diskusjoner av bioluminesens Imaging system. Dette arbeidet ble støttet av Core Research for evolusjonære Science and Technology (JPMJCR12W2) (R.K.), Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning på innovative områder (MEXT 24116705 for H.S. og MEXT 16H06480 for R.K.), Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning (C) (JSP 18K06254) (H.S.), Takeda Foundation (R.K. og H.S.), og plattform for dynamiske tilnærminger til Living system fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi, Japan.
Materials
| Bioluminescence Imaging System | |||
| Chilled water circulator (chiller) | Julabo | Model: F12-ED | |
| Cooled CCD camera | Andor Technology | Model: iKon-M 934 | |
| Incubator system | TOKAI HIT | Model: INU-ONICS | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX81 | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX83 | |
| LED illumination device | CoolLED | Model: pE1 | |
| MetaMorph | MOLECULAR DEVICES | Model: 40000 | |
| Mix gas controller | Tokken | Model: TK-MIGM OLO2 | |
| Objective lens | Olympus | Model: UPLFLN 40X O | |
| Preparations for Dissection | |||
| Dissection microscope | Nikon | Model: SMZ-2B | |
| Fluorescence stereoscopic microscope | Leica | Model: MZ16FA | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Scissors, Micro scissors | |||
| Forceps | |||
| Ring-shaped forceps | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Reagents for NPC dissociation culture | |||
| B27 supplement | invitrogen | 12587-010 | |
| bFGF | invitrogen | 13256-029 | Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS |
| D-luciferin | Nacalai Tesque | 01493-85 | Stock solution: 100mM in 0.9% saline |
| DNase | Worthington Biochemical Corporation | LK003172 | Stock solution: 1000U/ml in EBSS |
| EBSS | Worthington Biochemical Corporation | LK003188 | |
| Glass bottom dish | IWAKI | 3910-035 | |
| N2 supplement (100x) | invitrogen | 17502-048 | |
| N-acetyl-cystein | Sigma | A-9165-25G | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LK003178 | Stock solution: 7U/ml in EBSS |
| Penicillin/Streptmycine | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P-6281 | 40 mg/ml in DW |
| Preparations for in utero electroporation | |||
| 50-ml syringe | TERUMO | 181228T | |
| Electrode | Neppagene | 7-mm | |
| Electroporator | Neppagene | CUY21 EDIT | |
| Forceps | |||
| Gauzes | Kawamoto co. | 7161 | |
| Micro capillary | Made in-house | ||
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Pentbarbital | Kyoritsuseiyaku | Somnopentyl | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Suture needle | Akiyama MEDICAL MFG. CO | F17-40B2 | |
| Xylazine | Bayer | Seractal | |
| Preparations for Slice culture | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| Culture insert | Millipore | PICM01250 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012-500ML | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Forceps | |||
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Micro surgical knife | Alcon | 19 Gauge V-Lance | |
| Multi-gas incubator | Panasonic | MCO-5MUV-PJ | |
| N2/B27 media | Made in-house | ref. NPC dissociatioin culture | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Silicon rubber cutting board | Made in-house |
References
- Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. Basic helix-loop-helix factors in cortical development. Neuron. 39, 13-25 (2003).
- Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development. Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Paridaen, J. T., Huttner, W. B. Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system. EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).
- Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. Notch signaling in vertebrate neural development. Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).
- Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks. Neuron. 69, 840-855 (2011).
- Bray, S. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
- Bray, S. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).
- Kopan, R., Ilagan, M. X. G. The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism. Cell. 137, 216-233 (2009).
- Ishibashi, M., et al. Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system. The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).
- Ohtsuka, T., et al. Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation. The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).
- Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain. Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).
- Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis. Development. 134, 1243-1251 (2007).
- Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors. Neuron. 58, 52-64 (2008).
- Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Shimojo, H., et al. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes and Development. 30, 102-116 (2016).
- Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
- Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition. Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).
- Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).
- Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342, 1193-1200 (2013).
- Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152, 945-956 (2013).
- Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice. Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).
- Yamaguchi, S., et al. Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
- Kiyohara, Y. B., et al. The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).
- Behar, M., Hoffmann, A. Understanding the temporal codes of intra-cellular signals. Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic Gene Expression in a Single Cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
- Nelson, D. E., et al. Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression. Science. 306, 704-708 (2004).
- Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
- Hansen, A. S., O’Shea, E. K. Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression. Molecular Systems Biology. 9, 704 (2014).
- Hansen, A. S., O’Shea, E. K. cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale. Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).
- Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo. Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).
- Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: Progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
- Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay. Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).
- Nakajima, Y., et al. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, (2010).
- Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12, (2013).
