تحديد المنظمين رواية نتح النبات من خلال فحص التصوير الحراري على نطاق واسع في Helianthus Annuus
Summary
نحن نقدم طريقة لتحديد المغيرات من نتح الأوراق من خلال فحص واسع النطاق لمكتبة مركبة.
Abstract
يخضع تكيف النباتات مع الضغوط الحيوية واللاأحيائية لمجموعة متنوعة من العوامل، من بينها تنظيم فتحة الفم استجابة لعجز المياه أو مسببات الأمراض يلعب دوراً حاسماً. وبالتالي فإن تحديد الجزيئات الصغيرة التي تنظم حركة الفم يمكن أن يسهم في فهم الأساس الفسيولوجي الذي تتكيف به النباتات مع بيئتها. وتنطوي نُهج الفحص واسعة النطاق التي استُخدمت لتحديد منظمي حركة الفم على قيود محتملة: فبعضها يعتمد اعتماداً كبيراً على مسار الإشارات الهرمونية لحمض الاستئصال( ABA) ، وبالتالي يستبعد الآليات المستقلة عن ABA ، في حين يعتمد البعض الآخر على مراقبة الآثار الفسيولوجية غير المباشرة طويلة الأجل مثل نمو النبات وتطوره. تسمح طريقة الفحص المعروضة هنا بالمعالجة الواسعة النطاق للنباتات مع مكتبة من المواد الكيميائية إلى جانب القياس الكمي المباشر لنتحانها عن طريق التصوير الحراري. وبما أن تبخر الماء من خلال النتح يؤدي إلى تبريد سطح الورقة، فإن التصوير الحراري يوفر نهجًا غير جراحي للتحقيق في التغيرات في التوصيل اتوماتيالي بمرور الوقت. في هذا البروتوكول ، تزرع شتلات Helianthus annuus هيدروبولونيثم ثم تعامل بتغذية الجذر ، حيث يتم قطع الجذر الأساسي وغمسه في المادة الكيميائية التي يتم اختبارها. التصوير الحراري تليها التحليل الإحصائي للتغيرات في درجة الحرارة cotyledonary مع مرور الوقت يسمح لتحديد جزيئات النشطة بيولوجيا تحوير فتحة الفم. وتبين تجاربنا لإثبات مفهوم أن مادة كيميائية يمكن حملها من جذر القطع إلى كوتيليدون من شتلة عباد الشمس في غضون 10 دقائق. بالإضافة إلى ذلك ، عندما يتم التعامل مع النباتات مع ABA كتحكم إيجابي ، يمكن اكتشاف زيادة في درجة حرارة سطح الورقة في غضون دقائق. وهكذا تسمح طريقتنا بتحديد كفاءة وسرعة الجزيئات الجديدة التي تنظم فتحة الفتحة.
Introduction
تحمل الإجهاد في النباتات هو سمة متعددة الجينات تتأثر بمجموعة متنوعة من الميزات الجزيئية والخلوية والتنموية والفسيولوجية والآليات1. تحتاج النباتات في بيئة متقلبة إلى تعديل حركاتها الستومائية باستمرار لتحقيق التوازن بين الطلب الضوئي على الكربون مع الحفاظ على كمية كافية من المياه ومنع غزو مسببات الأمراض2؛ ومع ذلك، فإن الآليات التي يتم بها اتخاذ هذه “القرارات” المفاضلة غير مفهومة بشكل جيد3. إدخال جزيئات النشطة بيولوجيا في النباتات يمكن أن تعدل علم وظائف الأعضاء وتساعد في التحقيق آليات جديدة للتنظيم.
الفحص على نطاق واسع من الجزيئات الصغيرة هي استراتيجية فعالة تستخدم في اكتشاف المخدرات المضادة للسرطان والمواد الدوائية للاختبارات لاختبار الآثار الفسيولوجية من مئات إلى آلاف الجزيئات في فترة قصيرة من الزمن4،5. في بيولوجيا النبات، وقد أظهرت فحص عالية الإنتاجية فعاليتها على سبيل المثال في تحديد الجزيء الاصطناعي pyrabactin6،فضلا عن اكتشاف مستقبلات طويلة سعى من حمض الاستئصال (ABA)7،8. ومنذ ذلك الحين ، تم تحديد ناهضات وخصوم مستقبلات ABA ، والجزيئات الصغيرة القادرة على تعديل تعبير جينات المراسلة القابلة للاختزال في ABA9،10،11،12،13،14،15. نهج الفرز عالية الإنتاجية المتاحة حاليا لتحديد المركبات الصغيرة التي يمكن أن تعدل فتحة الفم لها بعض العيوب: (1) البروتوكولات التي تدور حول مسار الإشارات ABA قد تمنع تحديد آليات ABA مستقلة جديدة، و (2) في استراتيجيات الجسم الحي المستخدمة لتحديد الجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجيا تعتمد في المقام الأول على آثارها الفسيولوجية على إنبات البذور أو نمو الشتلات، وليس على تنظيم نتح النبات في حد ذاته.
بالإضافة إلى ذلك ، في حين أن هناك العديد من الطرق لعلاج النباتات ذات الجزيئات النشطة بيولوجيا ، فإن معظمها ليست مناسبة تمامًا لدراسة واسعة النطاق لحركة الفم. باختصار ، فإن التقنيات الثلاث الأكثر شيوعًا هي تطبيق الأوراق عن طريق الرش أو الغمس ، وعلاج نظام الجذر ، وري الجذر. تطبيق أوراق لا يتوافق مع المنهجيات الأكثر شيوعا وسرعة لقياس الفتحة الستومات منذ وجود قطرات على سطح ورقة تتداخل مع جمع البيانات على نطاق واسع. القيود الرئيسية للري الجذري هي متطلبات حجم العينة الكبيرة ، والاحتفاظ المحتمل للمركبات بالعناصر في الغلاف الرهيزووسفير ، والاعتماد على التناول النشط للجذر.
هنا ، نقدم طريقة واسعة النطاق لتحديد المركبات الجديدة التي تنظم نتح النباتات التي لا تنطوي بالضرورة على آليات ABA – أو معروفة تستجيب للجفاف وتتيح معالجة فعالة وموثوقة للنباتات. في هذا النظام، يتم التعامل مع النباتات الأنوس Helianthus باستخدام نهج تغذية الجذر الذي يتكون من قطع الجذر الأساسي للشتلات التي تزرع هيدروبوغرافيا وغمس موقع قطع في محلول العينة. بمجرد المعالجة ، يتم قياس تأثير كل مركب على نتح النباتات باستخدام كاميرا التصوير الحراري بالأشعة تحت الحمراء. وبما أن أحد المحددات الرئيسية لدرجة حرارة سطح الورقة هو معدل التبخر من الورقة، يمكن ربط بيانات التصوير الحراري مباشرة بالتوصيل اتوماتيالي. وبالتالي فإن التغير النسبي في درجة حرارة الأوراق بعد المعالجة الكيميائية يوفر وسيلة مباشرة لقياس نتح النبات.
H. annuus هي واحدة من أكبر خمسة محاصيل البذور الزيتية في العالم16 والاكتشافات التي تتم مباشرة على هذا النبات قد تسهل نقل التكنولوجيا في المستقبل. بالإضافة إلى ذلك ، فإن شتلات H. annuus لها كوتيلدونكبيرة ومسطحة ، بالإضافة إلى جذر أساسي سميك ، والذي كان مثاليًا لتطوير هذا البروتوكول. ومع ذلك ، يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة مع النباتات الأخرى ومجموعة متنوعة من المركبات.
يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد الجزيئات القادرة على تشغيل إغلاق الفم أو تعزيز فتح الفم ، مما له آثار كبيرة على فهم الإشارات التي تنظم التوصيل اتوماسي وتكييف النبات مع البيئة تؤكد.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعتمد عدد المركبات التي يمكن اختبارها في يوم معين في الغالب على (1) المساحة الخاضعة للرقابة البيئية المتاحة لزراعة النباتات وأداء الشاشة ، وكذلك (2) عدد الأفراد الذين يمكن أن يشاركوا في الخطوة 6 من البروتوكول. نوصي باستخدام ثلاثة نسخ تجريبية لتدعيم تفسير النتائج بعد المعالجة الإحصائية. في ي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم العمل من قبل صناديق بدء كلية بومونا وصندوق منح بدء الأبحاث في هيرش (إلى FJ) بالإضافة إلى برنامج البيولوجيا الجزيئية في كلية بومونا من خلال برنامج مساعد مساعد الأبحاث الصيفية (إلى KG).
Materials
| 1020 plastic growing trays without drain holes | Standard 10 x 20 inch trays | ||
| 2.0 mL microtubes, capless | Genesee Scientific | 22-283NC | |
| Abscisic acid (ABA) | Sigma-Aldrich | A1049 | |
| Air pump | Active Aqua | AAPA7.8L | 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min |
| Airstones | |||
| Chemical compound library | MicroSource Discovery | Natural Product Collection | |
| Creative Versa-Tool (wood burning tool) | Nasco | 9724549 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Dwarf Sunspot Sunflower seeds | Outsidepride.com | ||
| Erythrosin B | Sigma-Aldrich | 200964 | |
| Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) | General Hydroponics | GL51GH1421.31.11 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Laptop | Dell | ||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Microdissection scissors | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| ResearchIR Software | FLIR | ||
| R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board | Insulfoam | ||
| Seedholders | Araponics | N/A | |
| Super Tub (plastic utility tub) | Maccourt | ST3608 | 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics |
| T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera | FLIR | FLIR-T62101 | Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop |
| Vermiculite | |||
| Water filter | SunSun | HW-304B Pro Canister Filter |
References
- Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. Plant adaptation to drought stress. F1000Research. 5, (2016).
- McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. Gate control: guard cell regulation by microbial stress. The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).
- Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. Revisiting the Plant’s Dilemma. Molecular Plant. 9 (1), 7-9 (2016).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
- Wigglesworth, M. J., Murray, D. C., Blackett, C. J., Kossenjans, M., Nissink, J. W. Increasing the delivery of next generation therapeutics from high throughput screening libraries. Current Opinion in Chemical Biology. 26, 104-110 (2015).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nature Chemical Biology. 3 (11), 716-721 (2007).
- Park, S. Y., et al. Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
- Ma, Y., et al. Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors. Science. 324 (5930), 1064-1068 (2009).
- Cao, M., et al. An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants. Cell Research. 23 (8), 1043-1054 (2013).
- Okamoto, M., et al. Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12132-12137 (2013).
- Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors. Trends in Plant Science. 20 (6), 330-332 (2015).
- Kim, T. H., et al. Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway. Current Biology. 21 (11), 990-997 (2011).
- Ito, T., et al. Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening. ChemBioChem. 16 (17), 2471-2478 (2015).
- Ye, Y., et al. A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors. Plant Physiology. 173 (4), 2356-2369 (2017).
- Takeuchi, J., et al. Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions. Nature Chemical Biology. 10 (6), 477-482 (2014).
- Rauf, S., et al. Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value. Journal of the Science of Food and Agriculture. 97 (7), 1997-2006 (2017).
- Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).
- Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).
- Merlot, S., et al. Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation. The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).
