Identification de nouveaux régulateurs de la transpiration végétale par le dépistage thermique à grande échelle à Helianthus Annuus
Summary
Nous fournissons une méthode pour identifier les modulateurs de la transpiration foliaire par le criblage à grande échelle d’une bibliothèque composée.
Abstract
L’adaptation des plantes aux stress biotiques et abiotiques est régie par une variété de facteurs, parmi lesquels la régulation de l’ouverture stomatale en réponse au déficit en eau ou aux agents pathogènes joue un rôle crucial. L’identification de petites molécules qui régulent le mouvement stomatal peut donc contribuer à comprendre la base physiologique par laquelle les plantes s’adaptent à leur environnement. Les approches de dépistage à grande échelle qui ont été utilisées pour identifier les régulateurs du mouvement stomatal ont des limites potentielles : certaines dépendent fortement de la voie de signalisation hormonale de l’acide abscisique (ABA), excluant ainsi les mécanismes indépendants de l’ABA, tandis que d’autres s’appuient sur l’observation d’effets physiologiques indirects à long terme tels que la croissance et le développement des plantes. La méthode de dépistage présentée ici permet le traitement à grande échelle des plantes avec une bibliothèque de produits chimiques couplé avec une quantification directe de leur transpiration par imagerie thermique. Puisque l’évaporation de l’eau par transpiration entraîne le refroidissement de surface des feuilles, l’imagerie thermique fournit une approche non invasive pour étudier les changements dans la conductance stomatale au fil du temps. Dans ce protocole, les semis d’annuus de Helianthus sont cultivés hydroponiquement et ensuite traités par l’alimentation de racine, dans lequel la racine primaire est coupée et trempée dans le produit chimique étant examiné. L’imagerie thermique suivie d’une analyse statistique des changements de température cotylédonnaires au fil du temps permet d’identifier les molécules bioactives modulant l’ouverture stomatale. Nos expériences de preuve de concept démontrent qu’un produit chimique peut être transporté de la racine coupée au cotylédon du semis de tournesol en 10 minutes. En outre, lorsque les plantes sont traitées avec aBA comme un contrôle positif, une augmentation de la température de surface des feuilles peut être détectée en quelques minutes. Notre méthode permet ainsi l’identification efficace et rapide de nouvelles molécules régulant l’ouverture stomatale.
Introduction
La tolérance au stress chez les plantes est un trait polygénique influencé par une variété de caractéristiques et de mécanismes moléculaires, cellulaires, développementaux et physiologiques1. Les plantes dans un environnement fluctuant doivent moduler continuellement leurs mouvements stomatals pour équilibrer la demande photosynthétique de carbone tout en maintenant suffisamment d’eau et en empêchant l’invasion pathogène2; cependant, les mécanismes par lesquels ces “décisions” de compromis sont prises sont mal compris3. L’introduction de molécules bioactives dans les plantes peut moduler leur physiologie et aider à sonder de nouveaux mécanismes de régulation.
Le dépistage à grande échelle de petites molécules est une stratégie efficace utilisée dans la découverte de médicaments anticancéreux et des essais pharmacologiques pour tester les effets physiologiques de centaines à milliers de molécules dans un court laps de temps4,5. En biologie végétale, le dépistage à haut débit a montré son efficacité par exemple dans l’identification de la molécule synthétique pyrabactin6, ainsi que la découverte du récepteur tant recherché de l’acide abscisique (ABA)7,8. Depuis lors, les agonistes et les antagonistes des récepteurs ABA, et les petites molécules capables de moduler l’expression des gènes de reporter ABA-inductibles ont été identifiés9,10,11,12,13,14,15. Les approches de dépistage à haut débit actuellement disponibles pour identifier les petits composés qui peuvent moduler l’ouverture stomatale présentent certains inconvénients : (i) les protocoles tournant autour de la voie de signalisation de l’ABA peuvent empêcher l’identification de nouveaux mécanismes indépendants de l’ABA, et (ii) les stratégies in vivo utilisées pour l’identification des petites molécules bioactives dépendent principalement de leurs effets physiologiques sur la germination des graines ou la croissance des semis, et non sur la régulation de la transpiration végétale.
En outre, bien qu’il existe de nombreuses façons de traiter les plantes avec des molécules bioactives, la plupart d’entre elles ne sont pas bien adaptés pour une étude à grande échelle du mouvement stomatal. En bref, les trois techniques les plus courantes sont l’application foliaire par pulvérisation ou trempage, le traitement du système racinaire, et l’irrigation des racines. L’application Foliar n’est pas compatible avec les méthodologies les plus courantes et les plus rapides pour mesurer l’ouverture stomatale puisque la présence de gouttelettes à la surface des feuilles interfère avec la collecte de données à grande échelle. Les principales limites de l’irrigation des racines sont les exigences importantes en volume d’échantillon, la rétention potentielle des composés par des éléments dans la rhizosphère et la dépendance à l’utilisation active des racines.
Ici, nous présentons une méthode à grande échelle pour identifier de nouveaux composés régulant la transpiration des plantes qui n’implique pas nécessairement des mécanismes aBA ou connus sensibles à la sécheresse et permet un traitement efficace et fiable des plantes. Dans ce système, les plantes helianthus annuus sont traitées à l’aide d’une approche d’alimentation des racines qui consiste à couper la racine primaire des semis cultivés hydroponiquement et à tremper le site de coupe dans la solution de l’échantillon. Une fois traité, l’effet de chaque composé sur la transpiration des plantes est mesuré à l’aide d’une caméra thermique infrarouge. Étant donné qu’un déterminant majeur de la température de surface des feuilles est le taux d’évaporation de la feuille, les données d’imagerie thermique peuvent être directement corrélées à la conductance stomatale. Le changement relatif de la température foliaire après le traitement chimique fournit ainsi un moyen direct de quantifier la transpiration de la plante.
H. annuus est l’une des cinq plus grandes cultures d’oléagineux au monde16 et les découvertes faites directement sur cette plante peuvent faciliter les futurs transferts de technologie. En outre, les semis de H. annuus ont de grands cotylédons plats, ainsi qu’une racine primaire épaisse, qui était idéale pour le développement de ce protocole. Cependant, cette méthode peut être facilement adaptée à d’autres plantes et à une variété de composés.
Ce protocole peut être utilisé pour identifier efficacement les molécules capables de déclencher la fermeture stomatale ou de promouvoir l’ouverture stomatale, ce qui a des implications majeures pour comprendre les signaux qui régulent la conductance stomatale et l’adaptation des plantes à l’environnement Souligne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le nombre de composés qui peuvent être testés un jour donné dépend principalement (i) de l’espace écologique disponible pour cultiver les plantes et effectuer l’écran, ainsi que (ii) le nombre d’individus qui peuvent être impliqués dans l’étape 6 du protocole. Nous recommandons l’utilisation de trois répliques expérimentales pour consolider l’interprétation des résultats après le traitement statistique. Dans une journée typique, une à deux personnes peuvent dépister 60 composés dans des tripliques sans…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les travaux ont été soutenus par Pomona College Start-up Funds et Hirsch Research Initiation Grants Fund (à FJ) ainsi que le Pomona College Molecular Biology Program par l’intermédiaire du Stellar Summer Research Assistant Program (à KG).
Materials
| 1020 plastic growing trays without drain holes | Standard 10 x 20 inch trays | ||
| 2.0 mL microtubes, capless | Genesee Scientific | 22-283NC | |
| Abscisic acid (ABA) | Sigma-Aldrich | A1049 | |
| Air pump | Active Aqua | AAPA7.8L | 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min |
| Airstones | |||
| Chemical compound library | MicroSource Discovery | Natural Product Collection | |
| Creative Versa-Tool (wood burning tool) | Nasco | 9724549 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Dwarf Sunspot Sunflower seeds | Outsidepride.com | ||
| Erythrosin B | Sigma-Aldrich | 200964 | |
| Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) | General Hydroponics | GL51GH1421.31.11 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Laptop | Dell | ||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Microdissection scissors | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| ResearchIR Software | FLIR | ||
| R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board | Insulfoam | ||
| Seedholders | Araponics | N/A | |
| Super Tub (plastic utility tub) | Maccourt | ST3608 | 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics |
| T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera | FLIR | FLIR-T62101 | Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop |
| Vermiculite | |||
| Water filter | SunSun | HW-304B Pro Canister Filter |
References
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