Identificação de novos reguladores de transpiração vegetal por triagem de imagens térmicas em larga escala em Helianthus Annuus
Summary
Fornecemos um método para identificar moduladores de transpiração foliar através de triagem em larga escala de uma biblioteca composta.
Abstract
A adaptação vegetal ao estresse biótico e abiótico é regida por uma variedade de fatores, entre os quais a regulação da abertura estomatal em resposta ao déficit hídrico ou patógenos desempenha um papel crucial. Identificar pequenas moléculas que regulam o movimento estomatal pode, portanto, contribuir para entender a base fisiológica pela qual as plantas se adaptam ao seu ambiente. Abordagens de triagem em larga escala que têm sido usadas para identificar reguladores do movimento estomatal têm limitações potenciais: algumas dependem fortemente da via de sinalização hormonal de ácido abscisico (ABA), excluindo assim mecanismos independentes da ABA, enquanto outros dependem da observação de efeitos fisiológicos indiretos e de longo prazo, como crescimento e desenvolvimento vegetal. O método de triagem aqui apresentado permite o tratamento em larga escala de plantas com uma biblioteca de produtos químicos juntamente com uma quantificação direta de sua transpiração por imagem térmica. Uma vez que a evaporação da água através da transpiração resulta em resfriamento da superfície da folha, a imagem térmica fornece uma abordagem não invasiva para investigar mudanças na condução estomatal ao longo do tempo. Neste protocolo, as mudas de helianthus annuus são cultivadas hidroponicamente e depois tratadas pela alimentação radicular, na qual a raiz primária é cortada e mergulhada no produto químico que está sendo testado. A imagem térmica seguida de análise estatística das mudanças de temperatura cotyledonary ao longo do tempo permite a identificação de moléculas bioativas modulando abertura estomatal. Nossos experimentos de prova de conceito demonstram que um produto químico pode ser transportado da raiz cortada até o cotyledon da muda de girassol dentro de 10 minutos. Além disso, quando as plantas são tratadas com ABA como um controle positivo, um aumento na temperatura da superfície da folha pode ser detectado em poucos minutos. Nosso método permite, assim, a identificação eficiente e rápida de novas moléculas que regulam a abertura estomatal.
Introduction
A tolerância ao estresse nas plantas é um traço poligênico influenciado por uma variedade de características moleculares, celulares, dedesenvolvimento e fisiológicas e mecanismos1. As plantas em um ambiente flutuante precisam modular continuamente seus movimentos estomatais para equilibrar a demanda fotossintética por carbono, mantendo água suficiente e prevenindo a invasão de patógenos2; no entanto, os mecanismos pelos quais essas “decisões” de trade-off são tomadas são mal compreendidas3. Introduzir moléculas bioativas em plantas pode modular sua fisiologia e ajudar a sondar novos mecanismos de regulação.
O rastreamento em larga escala de pequenas moléculas é uma estratégia eficaz usada na descoberta de medicamentos anticâncer e ensaios farmacológicos para testar os efeitos fisiológicos de centenas a milhares de moléculas em um curto período de tempo4,5. Na biologia vegetal, a triagem de alto desempenho tem mostrado sua eficácia, por exemplo, na identificação da molécula sintética pyrabactin6, bem como na descoberta do tão procurado receptor de ácido abscisico (ABA)7,8. Desde então, agonistas e antagonistas de receptores ABA, e pequenas moléculas capazes de modular a expressão de genes repórteres indutíveis da ABA foram identificados9,10,11,12,13,14,15. Abordagens de triagem de alto-throughput atualmente disponíveis para identificar pequenos compostos que podem modular abertura estomatal têm algumas desvantagens: (i) protocolos girando em torno da via de sinalização ABA podem impedir a identificação de novos mecanismos independentes da ABA, e (ii) em estratégias in vivo utilizadas para a identificação de pequenas moléculas bioativas dependem principalmente de seus efeitos fisiológicos na germinação ou muda de crescimento de sementes, e não na regulação da transpiração vegetal por seção.
Além disso, embora existam muitas maneiras de tratar plantas com moléculas bioativas, a maioria delas não são adequadas para um estudo em larga escala do movimento estomatal. Resumidamente, as três técnicas mais comuns são a aplicação foliar, pulverizando ou mergulhando, tratamento do sistema radicular e irrigação de raízes. A aplicação foliar não é compatível com as metodologias mais comuns e rápidas para medir a abertura estomatal, uma vez que a presença de gotículas na superfície da folha interfere na coleta de dados em larga escala. As principais limitações da irrigação raiz são os grandes requisitos de volume amostral, a retenção potencial dos compostos por elementos na rizosfera e a dependência da captação ativa da raiz.
Aqui, apresentamos um método em larga escala para identificar novos compostos que regulam a transpiração vegetal que não envolve necessariamente mecanismos aba ou conhecidos de resposta à seca e permite um tratamento eficiente e confiável das plantas. Neste sistema, as plantas helianthus annuus são tratadas usando uma abordagem de alimentação raiz que consiste em cortar a raiz primária das mudas cultivadas hidroponicamente e mergulhar o local cortado na solução amostral. Uma vez tratado, o efeito de cada composto na transpiração das plantas é medido usando uma câmera de imagem térmica infravermelha. Uma vez que um grande determinante da temperatura da superfície da folha é a taxa de evaporação da folha, os dados de imagem térmica podem estar diretamente correlacionados com a condução estomatal. A mudança relativa na temperatura foliar após o tratamento químico fornece, assim, um meio direto para quantificar a transpiração da planta.
H. annuus é uma das cinco maiores culturas de oleaginosas do mundo16 e descobertas feitas diretamente nesta planta podem facilitar futuras transferências de tecnologia. Além disso, as mudas h. annuus possuem cotyledons grandes e planas, bem como uma raiz primária grossa, que era ideal para o desenvolvimento deste protocolo. No entanto, este método pode ser prontamente adaptado a outras plantas e uma variedade de compostos.
Este protocolo pode ser usado para identificar efetivamente moléculas capazes de desencadear o fechamento estomatal ou promover a abertura estomatal, o que tem grandes implicações para entender os sinais que regulam a condução estomatal e a adaptação vegetal ao meio ambiente Salienta.
Protocol
Representative Results
Discussion
O número de compostos que podem ser testados em um determinado dia depende principalmente do espaço ambientalmente controlado disponível para cultivar as plantas e realizar a tela, bem como (ii) o número de indivíduos que podem estar envolvidos na etapa 6 do protocolo. Recomendamos o uso de três réplicas experimentais para consolidar a interpretação dos resultados após o tratamento estatístico. Em um dia típico, um a dois indivíduos pode tela 60 compostos em triplicados sem dificuldade testando, por exemplo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho foi apoiado pela Pomona College Start-up Funds e Hirsch Research Initiation Grants Fund (to FJ), bem como o Programa de Biologia Molecular da Faculdade pomona através do Programa Assistente de Pesquisa de Verão Estelar (para KG).
Materials
| 1020 plastic growing trays without drain holes | Standard 10 x 20 inch trays | ||
| 2.0 mL microtubes, capless | Genesee Scientific | 22-283NC | |
| Abscisic acid (ABA) | Sigma-Aldrich | A1049 | |
| Air pump | Active Aqua | AAPA7.8L | 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min |
| Airstones | |||
| Chemical compound library | MicroSource Discovery | Natural Product Collection | |
| Creative Versa-Tool (wood burning tool) | Nasco | 9724549 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Dwarf Sunspot Sunflower seeds | Outsidepride.com | ||
| Erythrosin B | Sigma-Aldrich | 200964 | |
| Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) | General Hydroponics | GL51GH1421.31.11 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Laptop | Dell | ||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Microdissection scissors | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| ResearchIR Software | FLIR | ||
| R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board | Insulfoam | ||
| Seedholders | Araponics | N/A | |
| Super Tub (plastic utility tub) | Maccourt | ST3608 | 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics |
| T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera | FLIR | FLIR-T62101 | Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop |
| Vermiculite | |||
| Water filter | SunSun | HW-304B Pro Canister Filter |
References
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