זיהוי של הרגולטורים הרומן של דיות צמח על ידי הקרנת הדמיה תרמית בקנה מידה גדול בהליוציץ השנתי
Summary
אנו מספקים שיטה לזיהוי מודולים של דיות שקרנים על ידי הקרנת בקנה מידה גדול של ספריה מורכבת.
Abstract
עיבוד הצמח ללחצים ביוטיים ובין מדגיש הוא נשלט על ידי מגוון של גורמים, ביניהם התקנה של מיפתח הצמצם בתגובה לגירעון מים או פתוגנים ממלא תפקיד מכריע. זיהוי מולקולות קטנות המווסתים את התנועה לרפואת שיניים יכולה לתרום להבנת הבסיס הפיזיולוגי שממנו מסתגלים הצמחים לסביבתם. בקנה מידה גדול גישות הקרנה ששימשו לזיהוי הרגולטורים של התנועה יש מגבלות פוטנציאליות: כמה להסתמך בכבדות על חומצה אבציסית (ABA) הורמון איתות מסלול, ולכן להוציא מנגנונים עצמאיים aba, בעוד אחרים להסתמך על התבוננות של השפעות בלתי עקיפות, לטווח ארוך כגון צמיחה ופיתוח הצמח. שיטת ההקרנה המוצגת כאן מאפשרת טיפול בקנה מידה גדול של צמחים עם ספרייה של כימיקלים בשילוב עם קוונפיקציה ישירה של דיות שלהם על ידי הדמיה תרמית. מאז התאיידות של מים באמצעות תוצאות דיות הקירור משטח עלה, הדמיה תרמית מספק גישה לא פולשנית כדי לחקור שינויים העברת מוליכות לאורך זמן. בפרוטוקול זה, הליוציץ שתילים השנתי הם גדלו הידרופונטית ולאחר מכן מטופלים על ידי האכלה השורש, שבו השורש העיקרי הוא נחתך וטבול לתוך הכימיקל נבדק. הדמיה תרמית ואחריו ניתוח סטטיסטי של שינויי טמפרטורה cotyledonary במשך הזמן מאפשר זיהוי של מולקולות אקטיביים מודולים הצמצם שיניים. ניסויים הוכחת המושג שלנו להפגין כי כימית יכול להתבצע משורש לגזור את cotyledon של שתיל חמניות בתוך 10 דקות. בנוסף, כאשר הצמחים מטופלים עם ABA כפקד חיובי, עלייה בטמפרטורת פני העלה ניתן לזהות בתוך דקות. השיטה שלנו ובכך מאפשרת זיהוי יעיל ומהיר של מולקולות הרומן ויסות הצמצם.
Introduction
עמידות ללחץ בצמחים היא תכונה פוליגנית המושפעת ממגוון תכונות מולקולריות, סלולריות, התפתחותיות ופיזיולוגיות ומנגנונים1. הצמחים בסביבה התנודות צריך ברציפות לווסת את התנועות שלהם לאיזון הביקוש פוטוסינתטי עבור פחמן תוך שמירה על מספיק מים ומניעת פלישה הפתוגן2; עם זאת, המנגנונים שבהם החלטות אלה מתקבלות באופן מובן למדי3. היכרות אקטיביים מולקולות לצמחים יכול לווסת את הפיזיולוגיה שלהם ולעזור בחיטוט מנגנונים חדשים של רגולציה.
ההקרנה בקנה מידה גדול של מולקולות קטנות היא אסטרטגיה יעילה המשמשת לגילוי תרופות נגד סרטן ו הפרמקולוגית לבדוק את ההשפעות הפיזיולוגיות של מאות אלפי מולקולות בתקופה קצרה של זמן4,5. ב ביולוגיה של הצמח, הקרנת תפוקה גבוהה הראתה את יעילותו למשל בזיהוי של המולקולה הסינתטית pyrabactin6, כמו גם גילוי של הקולטן המבוקש של חומצה אבציסית (ABA)7,8. מאז, האגוניסטים והאנטוניסטים של קולטני אבא, מולקולות קטנות מסוגל לווסת את הביטוי של גנים העיתונאי aba-inducible זוהו9,10,11,12,13,14,15. תפוקה גבוהה ההקרנה גישות זמין כעת כדי לזהות תרכובות קטנות שיכולות לווסת את הצמצם שיניים יש כמה חסרונות: (i) הפרוטוקולים הסובבים סביב מסלול האיתות של ה-aba עשוי למנוע זיהוי של הספר הרומן מנגנונים עצמאיים, ו (ii) באסטרטגיות vivo המשמש לזיהוי מולקולות קטנות אקטיביים להסתמך בעיקר על ההשפעות הפיזיולוגיות שלהם על נביטה הזרע או שתיל צמיחה, ולא על התקנה של דיות הצמח כשלעצמה.
בנוסף, בעוד ישנן דרכים רבות לטיפול בצמחים עם מולקולות אקטיביים, רובם לא מתאימים למחקר בקנה מידה גדול של התנועה. בקצרה, שלוש הטכניקות הנפוצות ביותר הן היישום שקרן בריסוס או טבילה, טיפול במערכת השורש והשקיה בשורש. יישום שקרן אינו תואם למתודולוגיות הנפוצות והמהירות ביותר כדי למדוד את הצמצם מכיוון שנוכחותם של טיפות על פני העלה מפריעה לאיסוף נתונים בקנה מידה גדול. המגבלות המרכזיות של השקיה בשורש הן הדרישות נפח גדול המדגם, החזקת פוטנציאל של תרכובות על ידי אלמנטים בתוך הריון, ואת ההסתמכות על ספיגת השורש הפעיל.
כאן, אנו מציגים שיטה בקנה מידה גדול כדי לזהות תרכובות חדשות ויסות דיות הצמח שאינו מערב בהכרח את ABA-או מנגנוני תגובה בצורת מוכר ומאפשר טיפול יעיל ואמין של צמחים. במערכת זו, הליוציץ הצמחים השנתי מטופלים באמצעות גישה האכלה השורש המורכב של חיתוך השורש העיקרי של שתילים הידרופונטי ולטבול את האתר לחתוך לפתרון לדוגמה. לאחר טיפול, ההשפעה של כל תרכובת על דיות של צמחים נמדד באמצעות מצלמת אינפרא אדום תרמית הדמיה. כיוון שדטרמיננטה גדולה של טמפרטורת פני העלה היא שיעור האידוי מעלה, נתוני הדמיה תרמית יכולים להיות מתואמים במישרין לאופן מוליכות. השינוי היחסי בטמפרטורה שקרנית לאחר טיפול כימי ובכך מספק אמצעים ישירים לכמת את דיות הצמח.
H. שנתיות הוא אחד מחמשת גידולי הנפט הגדולים בעולם16 ותגליות שנעשו ישירות על צמח זה עשוי להקל על העברות עתידיות של הטכנולוגיה. בנוסף, שתילי ה-H. השנתי כוללים cotyledons גדולים ושטוחים, כמו גם שורש ראשי עבה, שהיה אידיאלי לפיתוח פרוטוקול זה. עם זאת, שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות לצמחים אחרים ומגוון של תרכובות.
פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות ביעילות מולקולות מסוגל להפעיל את הסגר שיניים או לקדם את הפתיחה, אשר יש השלכות מרכזיות על הבנת האותות המסדירים את היכולת לווסת את מוליכות ועיבוד הצמח לסביבה דגיש.
Protocol
Representative Results
Discussion
מספר תרכובות שניתן לבחון ביום נתון תלוי בעיקר ב (i) מרחב הסביבה מבוקרת זמין לגדל את הצמחים לבצע את המסך, כמו גם (ii) מספר אנשים שיכולים להיות מעורבים בשלב 6 של הפרוטוקול. אנו ממליצים להשתמש בשלושה משכפל ניסיוני כדי לגבש את הפרשנות של התוצאות לאחר טיפול סטטיסטי. ביום אופייני, אחד לשני אנשים יכול…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכת על ידי פומונה College הסטארט-up קרנות מלגות הירש מימון הקרן (FJ), כמו גם את תוכנית הביולוגיה מולקולרית של מכללת פומונה באמצעות תוכנית עוזר מחקר הקיץ של כוכבי (ק ג).
Materials
| 1020 plastic growing trays without drain holes | Standard 10 x 20 inch trays | ||
| 2.0 mL microtubes, capless | Genesee Scientific | 22-283NC | |
| Abscisic acid (ABA) | Sigma-Aldrich | A1049 | |
| Air pump | Active Aqua | AAPA7.8L | 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min |
| Airstones | |||
| Chemical compound library | MicroSource Discovery | Natural Product Collection | |
| Creative Versa-Tool (wood burning tool) | Nasco | 9724549 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Dwarf Sunspot Sunflower seeds | Outsidepride.com | ||
| Erythrosin B | Sigma-Aldrich | 200964 | |
| Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) | General Hydroponics | GL51GH1421.31.11 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Laptop | Dell | ||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Microdissection scissors | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| ResearchIR Software | FLIR | ||
| R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board | Insulfoam | ||
| Seedholders | Araponics | N/A | |
| Super Tub (plastic utility tub) | Maccourt | ST3608 | 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics |
| T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera | FLIR | FLIR-T62101 | Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop |
| Vermiculite | |||
| Water filter | SunSun | HW-304B Pro Canister Filter |
References
- Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. Plant adaptation to drought stress. F1000Research. 5, (2016).
- McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. Gate control: guard cell regulation by microbial stress. The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).
- Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. Revisiting the Plant’s Dilemma. Molecular Plant. 9 (1), 7-9 (2016).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
- Wigglesworth, M. J., Murray, D. C., Blackett, C. J., Kossenjans, M., Nissink, J. W. Increasing the delivery of next generation therapeutics from high throughput screening libraries. Current Opinion in Chemical Biology. 26, 104-110 (2015).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nature Chemical Biology. 3 (11), 716-721 (2007).
- Park, S. Y., et al. Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
- Ma, Y., et al. Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors. Science. 324 (5930), 1064-1068 (2009).
- Cao, M., et al. An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants. Cell Research. 23 (8), 1043-1054 (2013).
- Okamoto, M., et al. Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12132-12137 (2013).
- Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors. Trends in Plant Science. 20 (6), 330-332 (2015).
- Kim, T. H., et al. Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway. Current Biology. 21 (11), 990-997 (2011).
- Ito, T., et al. Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening. ChemBioChem. 16 (17), 2471-2478 (2015).
- Ye, Y., et al. A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors. Plant Physiology. 173 (4), 2356-2369 (2017).
- Takeuchi, J., et al. Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions. Nature Chemical Biology. 10 (6), 477-482 (2014).
- Rauf, S., et al. Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value. Journal of the Science of Food and Agriculture. 97 (7), 1997-2006 (2017).
- Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).
- Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).
- Merlot, S., et al. Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation. The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).
