Идентификация новых регуляторов транспирации растений путем масштабного теплового скрининга в Helianthus Annuus
Summary
Мы предоставляем метод для выявления модуляторов перепирания листа путем масштабного скрининга сложной библиотеки.
Abstract
Адаптация растений к биотическим и абиотическим стрессам регулируется целым рядом факторов, среди которых решающую роль играет регуляция стоматальной диафрагмы в ответ на дефицит воды или патогенные микроорганизмы. Выявление малых молекул, которые регулируют стоматального движения, может способствовать пониманию физиологической основы, с помощью которой растения адаптируются к окружающей среде. Крупномасштабные подходы скрининга, которые были использованы для выявления регуляторов стоматального движения, имеют потенциальные ограничения: некоторые в значительной степени полагаются на абскизиновой кислоты (ABA) гормональный сигнальный путь, поэтому исключая ABA-независимые механизмы, в то время как другие полагаются на наблюдение косвенных, долгосрочных физиологических эффектов, таких как рост и развитие растений. Представленный здесь метод скрининга позволяет проводить масштабную обработку растений библиотекой химических веществ в сочетании с прямой количественной оценкой их транспирации с помощью тепловизоров. Поскольку испарение воды через транспирацию приводит к охлаждению поверхности листьев, тепловизор обеспечивает неинвазивный подход к исследованию изменений в стоматальной проводимости с течением времени. В этом протоколе, Helianthus annuus саженцы выращиваются гидропонно, а затем лечение корневых кормления, в котором первичный корень вырезать и окунается в химическое вещество, тестируемое. Тепловизорс, за которым следует статистический анализ изменения температуры колидора с течением времени, позволяет выявить биоактивные молекулы, модулирующие стоматальную диафрагму. Наши эксперименты по проверке концепции показывают, что химическое вещество можно переносить из вырезанного корня в котиледон саженца подсолнечника в течение 10 минут. Кроме того, когда растения обрабатываются ABA в качестве положительного контроля, повышение температуры поверхности листьев может быть обнаружено в течение нескольких минут. Таким образом, наш метод позволяет эффективно и быстро идентифицировать новые молекулы, регулирующие стоматальную диафрагму.
Introduction
Стрессоустойчивость растений является полигенное признаки под влиянием различных молекулярных, клеточных, развития и физиологических особенностей и механизмов1. Растения в колеблющейся среде должны постоянно модулировать свои стомататные движения, чтобы сбалансировать фотосинтетический спрос на углерод, сохраняя при этом достаточную воду и предотвращая вторжение патогенов2; однако механизмы, с помощью которых принимаются эти компромиссные “решения”, плохо изучены3. Внедрение биологически активных молекул в растения может модулировать их физиологию и помочь в зондирования новых механизмов регулирования.
Крупномасштабный скрининг малых молекул является эффективной стратегией, используемой в открытии противораковых препаратов и фармакологических анализов для проверки физиологических эффектов сотен и тысяч молекул в течение короткого периода времени4,5. В биологии растений, высокой пропускной скрининг показал свою эффективность, например, в выявлении синтетической молекулы пирабактина6, а также открытие долгожданного рецептора абсциновой кислоты (АБА)7,8. С тех пор, агонисты и антагонисты рецепторов ABA, и небольшие молекулы, способные модулировать выражение ABA-индуцируемых генов репортера были определены9,10,11,12,13,14,15. Высокопроизводительные подходы скрининга в настоящее время доступны для выявления небольших соединений, которые могут модулировать стоматальной диафрагмы имеют некоторые недостатки: (i) протоколы, вращающиеся вокруг ABA сигнальный путь может предотвратить выявление новых ABA-независимых механизмов, и (ii) в виво стратегии, используемые для идентификации биоактивных малых молекул полагаться в первую очередь на их физиологическое воздействие на прорастания или саженство.
Кроме того, хотя существует множество способов лечения растений биологически активными молекулами, большинство из них не очень хорошо подходят для крупномасштабного исследования стоматарального движения. Короче говоря, три наиболее распространенных метода являются применение листвятки путем распыления или погружения, обработки корневой системы и корневого орошения. Приложение Foliar не совместимо с наиболее распространенными и быстрыми методологиями для измерения стоматаральной диафрагмы, так как наличие капель на поверхности листа мешает крупномасштабному сбору данных. Основными ограничениями корневого орошения являются большие потребности в объеме выборки, потенциальное удержание соединений элементами в ризосфере и зависимость от активного усвоения корней.
Здесь мы представляем крупномасштабный метод выявления новых соединений, регулирующих транспирацию растений, который не обязательно включает в себя аБА или известные механизмы реагирования на засуху и позволяет эффективно и надежно очищая растения. В этой системе, Helianthus annuus растения обрабатываются с использованием корневого кормления подход, который состоит из резки основного корня саженцев, выращенных гидропонно и погружения разреза в образец решения. После обработки влияние каждого соединения на транспирацию растений измеряется с помощью инфракрасной тепловизионной камеры. Поскольку основным фактором, определяющим температуру поверхности листьев, является скорость испарения из листа, тепловизионные данные могут быть непосредственно коррелированы с стоматальной проводимостью. Таким образом, относительное изменение температуры листа после химической обработки обеспечивает прямое средство количественной оценки транспирации растений.
H. annuus является одним из пяти крупнейших масличных культур в мире16 и открытий, сделанных непосредственно на этом заводе может облегчить будущие передачи технологии. Кроме того, H. annuus саженцы имеют большие и плоские котиледоны, а также толстый первичный корень, который был идеальным для развития этого протокола. Тем не менее, этот метод может быть легко адаптированы к другим растениям и различных соединений.
Этот протокол может быть использован для эффективной идентификации молекул, способных вызвать стоматальное закрытие или способствовать стоматальному открытию, что имеет серьезные последствия для понимания сигналов, которые регулируют стоматальную проводимость и адаптацию растений к окружающей среде Напряжения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Количество соединений, которые могут быть протестированы в данный день, в основном зависит от i) экологически контролируемого пространства, доступного для выращивания растений и выполнения экрана, а также (ii) числа лиц, которые могут быть вовлечены в шестой шаг протокола. Мы рекомендуем…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа была поддержана Помона колледж стартап фонды и Хирш исследований Инициация Гранты фонда (для FJ), а также Помона колледж молекулярной биологии программы через звездные летние исследования помощник программы (для KG).
Materials
| 1020 plastic growing trays without drain holes | Standard 10 x 20 inch trays | ||
| 2.0 mL microtubes, capless | Genesee Scientific | 22-283NC | |
| Abscisic acid (ABA) | Sigma-Aldrich | A1049 | |
| Air pump | Active Aqua | AAPA7.8L | 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min |
| Airstones | |||
| Chemical compound library | MicroSource Discovery | Natural Product Collection | |
| Creative Versa-Tool (wood burning tool) | Nasco | 9724549 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Dwarf Sunspot Sunflower seeds | Outsidepride.com | ||
| Erythrosin B | Sigma-Aldrich | 200964 | |
| Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) | General Hydroponics | GL51GH1421.31.11 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Laptop | Dell | ||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Microdissection scissors | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| ResearchIR Software | FLIR | ||
| R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board | Insulfoam | ||
| Seedholders | Araponics | N/A | |
| Super Tub (plastic utility tub) | Maccourt | ST3608 | 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics |
| T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera | FLIR | FLIR-T62101 | Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop |
| Vermiculite | |||
| Water filter | SunSun | HW-304B Pro Canister Filter |
References
- Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. Plant adaptation to drought stress. F1000Research. 5, (2016).
- McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. Gate control: guard cell regulation by microbial stress. The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).
- Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. Revisiting the Plant’s Dilemma. Molecular Plant. 9 (1), 7-9 (2016).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
- Wigglesworth, M. J., Murray, D. C., Blackett, C. J., Kossenjans, M., Nissink, J. W. Increasing the delivery of next generation therapeutics from high throughput screening libraries. Current Opinion in Chemical Biology. 26, 104-110 (2015).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nature Chemical Biology. 3 (11), 716-721 (2007).
- Park, S. Y., et al. Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
- Ma, Y., et al. Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors. Science. 324 (5930), 1064-1068 (2009).
- Cao, M., et al. An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants. Cell Research. 23 (8), 1043-1054 (2013).
- Okamoto, M., et al. Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12132-12137 (2013).
- Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors. Trends in Plant Science. 20 (6), 330-332 (2015).
- Kim, T. H., et al. Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway. Current Biology. 21 (11), 990-997 (2011).
- Ito, T., et al. Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening. ChemBioChem. 16 (17), 2471-2478 (2015).
- Ye, Y., et al. A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors. Plant Physiology. 173 (4), 2356-2369 (2017).
- Takeuchi, J., et al. Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions. Nature Chemical Biology. 10 (6), 477-482 (2014).
- Rauf, S., et al. Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value. Journal of the Science of Food and Agriculture. 97 (7), 1997-2006 (2017).
- Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).
- Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).
- Merlot, S., et al. Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation. The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).
