Helianthus Annuus'ta Büyük Ölçekli Termal Görüntüleme Taraması ile Bitki Transpirasyonunun Yeni Regülatörlerinin Belirlenmesi
Summary
Bir bileşik kitaplığın büyük ölçekli taraması ile foliar transpirasyon modülatörlerini tanımlamak için bir yöntem salıyoruz.
Abstract
Biyotik ve abiyotik streslere bitki adaptasyonu çeşitli faktörler tarafından yönetilir, aralarında su açığı veya patojenlere yanıt olarak stomatal diyafram düzenlenmesi önemli bir rol oynar. Bu nedenle stomatal hareketi düzenleyen küçük moleküllerin tanımlanması, bitkilerin çevrelerine uyum sağlamalarının fizyolojik temelini anlamalarına katkıda bulunabilir. Stomatal hareketin düzenleyicilerini tanımlamak için kullanılan büyük ölçekli tarama yaklaşımlarının potansiyel sınırlamaları vardır: bazıları abscisik asit (ABA) hormon sinyal yolu üzerinde yoğun olarak dayanır, bu nedenle ABA-bağımsız mekanizmalar hariç, diğerleri ise bitki büyümesi ve gelişimi gibi dolaylı, uzun vadeli fizyolojik etkilerin gözlemine dayanır. Burada sunulan tarama yöntemi, bitkilerin kimyasal bir kütüphane ile büyük ölçekli tedavi termal görüntüleme ile transpirasyon doğrudan bir nicelik selektib ile birleştiğinde sağlar. Yaprak yüzeyinin soğuması ile transpirasyon yoluyla suyun buharlaşması ndan, termal görüntüleme zaman içinde stomatal iletkenlik değişiklikleri araştırmak için non-invaziv bir yaklaşım sağlar. Bu protokolde Helianthus annuus fideleri hidroponik olarak yetiştirilir ve daha sonra kök besleme ile tedavi edilir, birincil kök kesilir ve test edilen kimyasal içine batırılır. Zaman içindeki kotoledoner sıcaklık değişikliklerinin istatistiksel analizini takip eden termal görüntüleme, stomatal diyafram açıklığını modüle eden biyoaktif moleküllerin tanımlanmasına olanak sağlar. Kavram kanıtı deneylerimiz, bir kimyasalın kesik kökten ayçiçeği fidesinin karyolasına 10 dakika içinde taşınabileceğini göstermektedir. Buna ek olarak, bitkiler olumlu bir kontrol olarak ABA ile tedavi edildiğinde, yaprak yüzey sıcaklığında bir artış birkaç dakika içinde tespit edilebilir. Böylece yöntemimiz stomatal diyafram açıklığını düzenleyen yeni moleküllerin etkin ve hızlı bir şekilde tanımlanmasını sağlar.
Introduction
Bitkilerde stres toleransı moleküler, hücresel, gelişimsel ve fizyolojik özellikleri ve mekanizmaları çeşitli etkilenmiştir polijenik bir özelliktir1. Dalgalı bir ortamda bitkiler sürekli yeterli su muhafaza ve patojen invazyonu önlerken karbon için fotosentetik talebi dengelemek için stomatal hareketlerini modüle etmek gerekir2; ancak, bu trade-off “kararlar” tarafından yapılan mekanizmalar kötü anlaşılmaktadır3. Biyoaktif moleküllerin bitkilere tanıtılması fizyolojilerini modüle edebilir ve yeni düzenleme mekanizmalarının araştırılmasına yardımcı olabilir.
Küçük moleküllerin büyük ölçekli tarama kısa bir süre içinde moleküllerin binlerce yüzlerce fizyolojik etkilerini test etmek için anti-kanser ilaç keşif ve farmakolojik tahliller kullanılan etkili birstratejidir 4,5. Bitki biyolojisinde, yüksek iş bölümü taraması örneğin sentetik molekül pyrabactin6’nın belirlenmesinde ve abscisik asit (ABA)7,8’inuzun zamandır aranan reseptörünün keşfinde etkinliğini göstermiştir. O zamandan beri, ABA reseptörlerinin agonistleri ve antagonistleri ve ABA indüklenebilir muhabir genlerin ekspresyonunu modüle edebilecek küçük moleküller tespit edilmiştir9,10,11,12,13,14,15. Stomatal diyafram ı modüle edilebilen küçük bileşikleri tanımlamak için mevcut olan yüksek iş gücü tarama yaklaşımlarının bazı sakıncaları vardır: (i) ABA sinyal yolu etrafında dönen protokoller yeni ABA-bağımsız mekanizmaların tanımlanmasını engelleyebilir ve (ii) biyoaktif küçük moleküllerin tanımlanmasında kullanılan in vivo stratejileri öncelikle tohum çimlenmesi veya tohumlama perling büyümesi üzerindeki fizyolojik etkilerine dayanır, bitki transpirasyonun düzenlenmesine değil.
Ayrıca, biyoaktif moleküller ile bitkilerin tedavisinde birçok yolu olmakla birlikte, bunların çoğu iyi stomatal hareketin büyük ölçekli bir çalışma için uygun değildir. Kısaca, üç en yaygın teknikleri püskürtme veya daldırma, kök sisteminin tedavisi ve kök sulama ile foliar uygulamasıdır. Yaprak yüzeyinde damlacıkların varlığı büyük ölçekli veri toplama ile engel olduğundan Foliar uygulaması stomatal diyafram ölçmek için en yaygın ve hızlı metodolojileri ile uyumlu değildir. Kök sulamanın başlıca sınırlamaları büyük numune hacmi gereksinimleri, bileşiklerin rizosferdeki elementler tarafından potansiyel olarak tutulması ve aktif kök alımına duyulan güvendir.
Burada, mutlaka ABA içermeyen bitki transpirasyon unu düzenleyen yeni bileşikler belirlemek için büyük ölçekli bir yöntem salıyoruz- veya bilinen kuraklık duyarlı mekanizmalar ve bitkilerin verimli ve güvenilir tedavi sağlar. Bu sistemde Helianthus annuus bitkileri, hidroponik olarak yetiştirilen fidelerin ana kökünü kesmeve kesme alanını numune çözeltisine daldırmaktan oluşan bir kök besleme yaklaşımı kullanılarak tedavi edilir. Tedavi edildikten sonra, bitkilerin transpirasyonu üzerinde her bileşiğin etkisi kızılötesi termal görüntüleme kamerası kullanılarak ölçülür. Yaprak yüzey sıcaklığının önemli bir belirleyicisi yapraktan buharlaşma oranı olduğundan, termal görüntüleme verileri stomatal iletkenlik ile doğrudan ilişkili olabilir. Kimyasal arıtma sonrasında foliar sıcaklığındaki göreceli değişim böylece bitki transpirasyon ölçmek için doğrudan bir araç sağlar.
H. annuus dünyanın en büyük beş yağlı tohum bitkileri biridir16 ve keşifler doğrudan bu bitki üzerinde yapılan teknolojinin gelecekteki transferleri kolaylaştırabilir. Buna ek olarak, H. annuus fideleri büyük ve düz cotyledons yanı sıra kalın bir birincil kök, bu protokolün geliştirilmesi için ideal olan var. Ancak, bu yöntem kolayca diğer bitkiler ve bileşiklerin çeşitli adapte edilebilir.
Bu protokol, stomatal kapanmayı tetikleyebilen molekülleri etkili bir şekilde tanımlamak veya stomatal açıklığı teşvik etmek için kullanılabilir, bu da stomatal iletkenliği ve bitki adaptasyonlarını düzenleyen sinyalleri anlamak için önemli sonuçlar doğurabilir. strese neden olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Belirli bir günde test edilebilen bileşiklerin sayısı çoğunlukla (i) bitkileri büyütmek ve ekranı gerçekleştirmek için mevcut olan çevre kontrollü alana ve (ii) protokolün 6. İstatistiksel tedavi den sonra sonuçların yorumlanmasını pekiştirmek için üç deneysel kopya kullanılmasını öneriyoruz. Tipik bir günde, bir ila iki kişi örneğin [60 kimyasallar + 6 negatif (DMSO) kontrolleri + 3 pozitif (ABA) kontrolleri] sabah, öğle ve öğleden sonra] test ederek zorlanmadan triplicates 60 bileşi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma, Pomona College Start-up Funds ve Hirsch Research Inisiation Grants Fund (FJ’ye) ve Yıldız Yaz Araştırma Görevlisi Programı (KG) aracılığıyla Pomona College Moleküler Biyoloji Programı tarafından desteklendi.
Materials
| 1020 plastic growing trays without drain holes | Standard 10 x 20 inch trays | ||
| 2.0 mL microtubes, capless | Genesee Scientific | 22-283NC | |
| Abscisic acid (ABA) | Sigma-Aldrich | A1049 | |
| Air pump | Active Aqua | AAPA7.8L | 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min |
| Airstones | |||
| Chemical compound library | MicroSource Discovery | Natural Product Collection | |
| Creative Versa-Tool (wood burning tool) | Nasco | 9724549 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Dwarf Sunspot Sunflower seeds | Outsidepride.com | ||
| Erythrosin B | Sigma-Aldrich | 200964 | |
| Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) | General Hydroponics | GL51GH1421.31.11 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Laptop | Dell | ||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Microdissection scissors | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| ResearchIR Software | FLIR | ||
| R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board | Insulfoam | ||
| Seedholders | Araponics | N/A | |
| Super Tub (plastic utility tub) | Maccourt | ST3608 | 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics |
| T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera | FLIR | FLIR-T62101 | Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop |
| Vermiculite | |||
| Water filter | SunSun | HW-304B Pro Canister Filter |
References
- Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. Plant adaptation to drought stress. F1000Research. 5, (2016).
- McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. Gate control: guard cell regulation by microbial stress. The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).
- Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. Revisiting the Plant’s Dilemma. Molecular Plant. 9 (1), 7-9 (2016).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
- Wigglesworth, M. J., Murray, D. C., Blackett, C. J., Kossenjans, M., Nissink, J. W. Increasing the delivery of next generation therapeutics from high throughput screening libraries. Current Opinion in Chemical Biology. 26, 104-110 (2015).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nature Chemical Biology. 3 (11), 716-721 (2007).
- Park, S. Y., et al. Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
- Ma, Y., et al. Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors. Science. 324 (5930), 1064-1068 (2009).
- Cao, M., et al. An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants. Cell Research. 23 (8), 1043-1054 (2013).
- Okamoto, M., et al. Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12132-12137 (2013).
- Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors. Trends in Plant Science. 20 (6), 330-332 (2015).
- Kim, T. H., et al. Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway. Current Biology. 21 (11), 990-997 (2011).
- Ito, T., et al. Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening. ChemBioChem. 16 (17), 2471-2478 (2015).
- Ye, Y., et al. A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors. Plant Physiology. 173 (4), 2356-2369 (2017).
- Takeuchi, J., et al. Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions. Nature Chemical Biology. 10 (6), 477-482 (2014).
- Rauf, S., et al. Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value. Journal of the Science of Food and Agriculture. 97 (7), 1997-2006 (2017).
- Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).
- Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).
- Merlot, S., et al. Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation. The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).
