Identifikasjon av nye regulatorer av plantetranspirasjon ved storskala termisk bildebehandling screening i Helianthus Annuus
Summary
Vi tilbyr en metode for å identifisere modulatorer av foliar transpirasjon ved storskala screening av et sammensatt bibliotek.
Abstract
Plantetilpasning til biotiske og abiotiske påkjenninger styres av en rekke faktorer, blant annet regulering av stomatal blenderåpning som svar på vannunderskudd eller patogener spiller en avgjørende rolle. Identifisere små molekyler som regulerer stomatal bevegelse kan derfor bidra til å forstå det fysiologiske grunnlaget som planter tilpasser seg miljøet. Store screening tilnærminger som har blitt brukt til å identifisere regulatorer av stomatal bevegelse har potensielle begrensninger: noen stole tungt på abscisic acid (ABA) hormon signaling banen, derfor unntatt ABA-uavhengige mekanismer, mens andre stole på observasjon av indirekte, langsiktige fysiologiske effekter som plantevekst og utvikling. Screeningmetoden som presenteres her tillater storskala behandling av planter med et bibliotek av kjemikalier kombinert med en direkte kvantifisering av deres transpirasjon ved termisk avbildning. Siden fordampning av vann gjennom transpirasjon resulterer i bladoverflatekjøling, gir termisk avbildning en ikke-invasiv tilnærming til å undersøke endringer i stomatal konduktasjon over tid. I denne protokollen dyrkes Helianthus annuus frøplanter hydroponically og deretter behandlet ved rotfôring, der den primære roten kuttes og dyppes i kjemikaliet som testes. Termisk avbildning etterfulgt av statistisk analyse av kotyledonære temperaturendringer over tid gjør det mulig å identifisere bioaktive molekyler som modulerer stomatal blenderåpning. Våre konseptbeviseksperimenter viser at et kjemikalie kan bæres fra kuttroten til kosedonen til solsikkefrøingen innen 10 minutter. I tillegg, når planter behandles med ABA som en positiv kontroll, kan en økning i bladoverflatetemperaturen oppdages i løpet av minutter. Vår metode tillater dermed effektiv og rask identifisering av nye molekyler som regulerer stomatal blenderåpning.
Introduction
Stresstoleranse i planter er en polygen egenskap påvirket av en rekke molekylære, cellulære, utviklingsmessige og fysiologiske egenskaper og mekanismer1. Planter i et varierende miljø må kontinuerlig modulere sine stomatale bevegelser for å balansere den fotosyntetiske etterspørselen etter karbon samtidig som tilstrekkelig vann opprettholdes og forhindrer patogeninvasjon2; Men mekanismene som disse avveining “beslutninger” er gjort er dårlig forstått3. Innføring av bioaktive molekyler i planter kan modulere deres fysiologi og bidra til å undersøke nye reguleringsmekanismer.
Den store screeningen av små molekyler er en effektiv strategi som brukes i anti-kreft narkotika oppdagelse og farmakologiske analyser for å teste de fysiologiske effektene av hundrevis til tusenvis av molekyler i løpet av kort tid4,5. I plantebiologi har høy gjennomstrømning vist sin effektivitet for eksempel i identifisering av det syntetiske molekylet pyrabactin6, samt oppdagelsen av den ettertraktede reseptoren av abscisic acid (ABA)7,8. Siden da har agonister og antagonister av ABA-reseptorer, og små molekyler i stand til å modulere uttrykket av ABA-inducible reporter gener blitt identifisert9,10,11,12,13,14,15. Screeningtilnærminger med høy gjennomstrømning er tilgjengelig for å identifisere små forbindelser som kan modulere stomatal blenderåpning har noen ulemper: (i) protokoller som roterer rundt ABA-signalveien, kan forhindre identifisering av nye ABA-uavhengige mekanismer, og (ii) in vivo strategier som brukes for identifisering av bioaktive små molekyler stole primært på deres fysiologiske effekter på frø spiring eller frøplante vekst, og ikke på regulering av plantetranspirasjon per se.
I tillegg, mens det er mange måter å behandle planter med bioaktive molekyler, er de fleste av dem ikke godt egnet for en storstilt studie av stomatal bevegelse. Kort, de tre vanligste teknikkene er foliar søknad ved sprøyting eller dypping, behandling av rotsystemet, og rot vanning. Foliar-applikasjonen er ikke kompatibel med de vanligste og raskeste metodene for å måle stomatal blenderåpning siden tilstedeværelsen av dråper på bladoverflaten forstyrrer storskala datainnsamling. De store begrensningene for rotvanning er de store kravene til prøvevolum, den potensielle oppbevaringen av forbindelsene ved elementer i jordsfæren, og avhengigheten av aktivt rotopptak.
Her presenterer vi en storstilt metode for å identifisere nye forbindelser som regulerer plantetranspirasjon som ikke nødvendigvis involverer ABA- eller kjente tørkeresponsive mekanismer og gir effektiv og pålitelig behandling av planter. I dette systemet behandles Helianthus annuus planter ved hjelp av en rotfôringstilnærming som består av å kutte den primære roten av frøplanter dyrket hydroponically og dyppe kuttstedet inn i prøveløsningen. Når behandlet, effekten av hver forbindelse på transpirasjon av planter måles ved hjelp av en infrarød termisk bildekamera. Siden en viktig determinant for bladoverflatetemperatur er frekvensen av fordampning fra bladet, kan termiske bildedata være direkte korrelert til stomatal konduktasjon. Den relative endringen i foliar temperatur etter kjemisk behandling gir dermed et direkte middel til å kvantifisere anlegget transpirasjon.
H. annuus er en av de fem største oljefrøavlingene i verden16 og funn gjort direkte på dette anlegget kan lette fremtidige overføringer av teknologi. I tillegg har H. annuus frøplanter store og flate kotyledoner, samt en tykk primærrot, som var ideell for utviklingen av denne protokollen. Denne metoden kan imidlertid lett tilpasses andre planter og en rekke forbindelser.
Denne protokollen kan brukes til effektivt å identifisere molekyler som kan utløse stomatal lukking eller fremme stomatal åpning, som har store implikasjoner for å forstå signalene som regulerer stomatal konduktisering og plantetilpasning til miljømessige Understreker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Antall forbindelser som kan testes på en gitt dag avhenger for det meste av (i) den miljøkontrollerte plassen som er tilgjengelig for å dyrke plantene og å utføre skjermen, samt (ii) antall personer som kan være involvert i trinn 6 i protokollen. Vi anbefaler bruk av tre eksperimentelle replikaser for å konsolidere tolkningen av resultatene etter statistisk behandling. På en typisk dag kan en til to personer screene 60 forbindelser i triplicates uten problemer ved å teste for eksempel [60 kjemikalier + 6 negativ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeidet ble støttet av Pomona College Start-up Funds and Hirsch Research Initiation Grants Fund (til FJ) samt Pomona College Molecular Biology Program gjennom Stellar Summer Research Assistant Program (til KG).
Materials
| 1020 plastic growing trays without drain holes | Standard 10 x 20 inch trays | ||
| 2.0 mL microtubes, capless | Genesee Scientific | 22-283NC | |
| Abscisic acid (ABA) | Sigma-Aldrich | A1049 | |
| Air pump | Active Aqua | AAPA7.8L | 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min |
| Airstones | |||
| Chemical compound library | MicroSource Discovery | Natural Product Collection | |
| Creative Versa-Tool (wood burning tool) | Nasco | 9724549 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Dwarf Sunspot Sunflower seeds | Outsidepride.com | ||
| Erythrosin B | Sigma-Aldrich | 200964 | |
| Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) | General Hydroponics | GL51GH1421.31.11 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Laptop | Dell | ||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Microdissection scissors | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| ResearchIR Software | FLIR | ||
| R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board | Insulfoam | ||
| Seedholders | Araponics | N/A | |
| Super Tub (plastic utility tub) | Maccourt | ST3608 | 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics |
| T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera | FLIR | FLIR-T62101 | Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop |
| Vermiculite | |||
| Water filter | SunSun | HW-304B Pro Canister Filter |
References
- Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. Plant adaptation to drought stress. F1000Research. 5, (2016).
- McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. Gate control: guard cell regulation by microbial stress. The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).
- Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. Revisiting the Plant’s Dilemma. Molecular Plant. 9 (1), 7-9 (2016).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
- Wigglesworth, M. J., Murray, D. C., Blackett, C. J., Kossenjans, M., Nissink, J. W. Increasing the delivery of next generation therapeutics from high throughput screening libraries. Current Opinion in Chemical Biology. 26, 104-110 (2015).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nature Chemical Biology. 3 (11), 716-721 (2007).
- Park, S. Y., et al. Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
- Ma, Y., et al. Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors. Science. 324 (5930), 1064-1068 (2009).
- Cao, M., et al. An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants. Cell Research. 23 (8), 1043-1054 (2013).
- Okamoto, M., et al. Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12132-12137 (2013).
- Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors. Trends in Plant Science. 20 (6), 330-332 (2015).
- Kim, T. H., et al. Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway. Current Biology. 21 (11), 990-997 (2011).
- Ito, T., et al. Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening. ChemBioChem. 16 (17), 2471-2478 (2015).
- Ye, Y., et al. A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors. Plant Physiology. 173 (4), 2356-2369 (2017).
- Takeuchi, J., et al. Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions. Nature Chemical Biology. 10 (6), 477-482 (2014).
- Rauf, S., et al. Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value. Journal of the Science of Food and Agriculture. 97 (7), 1997-2006 (2017).
- Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).
- Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).
- Merlot, S., et al. Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation. The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).
