تصور الدماغ النامية في سمك الحمار الوحشي المعيشة باستخدام Brainbow والوقت الفاصل Confocal التصوير
Summary
في التصوير الحي هو أداة قوية يمكن استخدامها للتحقيق في الآليات الخلوية الكامنة وراء تطوير الجهاز العصبي. هنا نحن نصف تقنية لاستخدام الوقت الفاصل الكونستوب المجهري لتصور أعداد كبيرة من الخلايا متعددة الألوان بقوس قزح المسمى في الوقت الحقيقي داخل الجهاز العصبي حمار وحشي النامية.
Abstract
يتطلب تطوير الجهاز العصبي الفقاري تنسيقًا دقيقًا للسلوكيات والتفاعلات الخلوية المعقدة. يمكن أن يوفر استخدام الدقة العالية في تقنيات التصوير الحي نافذة واضحة على هذه العمليات في الكائن الحي. على سبيل المثال، يمكن اتباع تقسيم الخلايا وذريتها في الوقت الحقيقي مع تشكل الجهاز العصبي. في السنوات الأخيرة، أدت التطورات التقنية في التقنيات متعددة الألوان إلى توسيع أنواع الأسئلة التي يمكن التحقيق فيها. يمكن استخدام نهج Brainbow متعدد الألوان ليس فقط للتمييز بين الخلايا الشبيهة ، ولكن أيضًا لرمز اللون متعدد المستنسخين المختلفين للخلايا ذات الصلة التي تستمد كل منها من خلية ذرية واحدة. وهذا يسمح لتحليل النسب متعددة من العديد من المستنسخين مختلفة وسلوكياتهم في وقت واحد أثناء التنمية. هنا نحن نصف تقنية لاستخدام الوقت الفاصل الكونستوب المجهري لتصور أعداد كبيرة من الخلايا متعددة الألوان بقوس قزح المسمى على مدى الوقت الحقيقي داخل الجهاز العصبي حمار وحشي النامية. هذا مفيد بشكل خاص لمتابعة التفاعلات الخلوية بين الخلايا مثل، والتي يصعب تسمية بشكل تفاضلي باستخدام الألوان التقليدية التي يحركها المروج. يمكن استخدام نهجنا لتتبع علاقات النسب بين استنساخ مختلفة متعددة في وقت واحد. توفر مجموعات البيانات الكبيرة التي تم إنشاؤها باستخدام هذه التقنية معلومات غنية يمكن مقارنتها كمًا عبر التلاعب الجيني أو الدوائي. في نهاية المطاف يمكن أن تساعد النتائج التي تم إنشاؤها في الإجابة على أسئلة منهجية حول كيفية تطور الجهاز العصبي.
Introduction
في المراحل المبكرة من التنمية، تنقسم برك الخلايا السلف المتخصصة بشكل متكرر في مناطق تكاثرية، وتنتج صفائف متنوعة من خلايا الابنة. الخلايا التي ولدت خلال هذه الفترة التنموية ثم التفريق والسفر لتشكيل الأعضاء الوليدة. في الجهاز العصبي، السلفمثل غليا شعاعي تؤدي إلى خلايا عصبية غير ناضجة في مناطق البطين. كما تهاجر الخلايا العصبية بعيدا عن البطينين وناضجة, الأنسجة توسيع يشكل في نهاية المطاف هياكل معقدة للغاية من الدماغ1,,2,,3,,4,,5,,6. التنسيق بين تقسيم السلف والتمايز وهجرة الخلايا العصبية سيحدد الحجم النهائي والشكل ، وبالتالي وظيفة الدماغ ، مما يؤثر بشكل مباشر على السلوك7،8،9،10. وفي حين أن الرقابة الصارمة على هذه العمليات أمر بالغ الأهمية لتطور الدماغ الطبيعي، فإن الآليات العالمية التي تنظم هذه الديناميات ليست مفهومة جيداً. هنا نحن نصف أداة لدراسة تطور الجهاز العصبي في قرار الخلوية، مما يسمح للباحثين لتصور الخلايا السلف والخلايا العصبية في الجسم الحي في الدماغ حمار وحشي النامية مع Brainbow وتتبع سلوكهم مع مرور الوقت عن طريق المجهر confocal الفاصل الزمني11. ويمكن أيضا تكييف هذا النهج لتصور أجزاء أخرى من الجنين النامي.
لمراقبة والتمييز بين الخلايا في الدماغ الحمار الوحشي النامية، قمنا بتكييف تقنية تسمية خلايا بقوس قزح11. يستخدم Brainbow التعبير الجمعي المحدد عشوائيًا لثلاثة بروتينات فلورية متميزة (FPs) لتسمية مجموعة من الخلايا. في حين أن التعبير الافتراضي للتعبير Brainbow هو dTomato FP الأحمر ، إعادة التركيب بواسطة الإنزيم Cre recombinase النتائج في التعبير عن mCerulean (بروتين الفلورسنت السماوي ، CFP) أو البروتين الفلوري الأصفر (YFP)12،13. كمية مجتمعة من كل FP أعرب في خلية يعطيها هوى فريدة من نوعها، مما يسمح تمييز بصري واضح من الخلايا المجاورة. بالإضافة إلى ذلك، عندما يقسم خلية السلف، كل خلية ابنة سوف ترث اللون من الخلية الأم، وإنتاج استنساخ مرمزة بالألوان والسماح للباحثين لتتبع نسب الخلية11،14. في حين تستخدم أصلا لتحليل الدوائر العصبية في الفئران12, وقد تم منذ Brainbow وأعرب في مجموعة واسعة من الكائنات الحية نموذج, بما في ذلك حمار وحشي15.
بنيت تقنيتنا على طرق التصوير والتصوير السابقة متعددة الألوان لتصوير العديد من النسخ المرمزة بالألوان بشكل مباشر بمرور الوقت في سمك الحمار الوحشي الحي. نظرا لشفافيتها البصرية كأجنة، والحمار الوحشي هي مناسبة تماما لتجارب التصوير16،وقد استخدمت الدراسات السابقة Brainbow في حمار وحشي لدراسة مجموعة متنوعة من الأنسجة، بما في ذلك الجهاز العصبي11،,15،,17،,18،19،,20،,21،,22،,23،,24،,25،, , 26،27. القدرة على الصورة مباشرة في الكائن الحي، جنبا إلى جنب مع تطورها الرحمي السابق السريع، وجعل حمار وحشي نموذجا قيما للتنمية الفقارية. على النقيض من الدماغ الثدييات، والمنطقة التكاثرية بأكملها من hindbrain حمار وحشي هو متاح بسهولة للتصوير دون تعطيل لبيئتها الذاتية6. وهذا يسمح بإجراء التجارب في الكائن الحي، بدلا من في المختبر أو المستحضرات الأنسجة الثابتة. على النقيض من تجارب التصوير الثابتة ، في دراسات الجسم الحي تسمح بتصميم طولي ، وإنتاج ساعات من البيانات التي يمكن تحليلها للأنماط ، وبالتالي زيادة احتمال ملاحظة الأحداث النادرة نسبيًا. اعتمادا على سرعة وطول الأحداث ذات الاهتمام، قد يختار الباحثون لأداء قصيرة (1-2 ساعة) أو طويلة (تصل إلى ~ 16 ح) تجارب التصوير الفاصل الزمني. باستخدام مروج الصدمات الحرارية الحمار الوحشي 70 (hsp70، hsp)، يمكن التحكم في التعبير Brainbow مؤقتا28،29. بالإضافة إلى ذلك، التعبير الفسيفساء الناجمة عن هذا المروج هو مناسبة تماما لوضع العلامات وتتبع العديد من استنساخ11.
القدرة على التعرف بصريا استنساخ متعددة داخل الدماغ الحي هو ميزة من هذه الطريقة. الدراسات السابقة الهامة التي بحثت في دور استنساخ داخل تطوير الجهاز العصبي تستخدم ناقلات الفيروسات الرجعية لتسمية خلية ذرية واحدة وذريتها باستخدام FP واحد أو غيرها من البروتين تصور بسهولة. مثل هذه العلامات يسمح للباحثين لمراقبة استنساخ واحد مع مرور الوقت، إما في المختبر أو في الجسم الحي22،30، 31،,31,32،,33،34،,35،,36،,37،,38., على النقيض من أساليب لتتبع سلوك الخلايا داخل استنساخ واحد ، والألوان المتميزة من Brainbow تسمح للباحثين لمراقبة ديناميات بين استنساخ. بالإضافة إلى ذلك، باستخدام Brainbow لتسمية العديد من المستنسخين داخل الدماغ، يتم جمع بيانات إضافية عن السلوك البرسيم نسبة إلى التقنيات التي تسمية استنساخ واحد11. والأهم من ذلك، يمكن توسيع النهج الموصوفة هنا لتوليد مقارنات تنموية بين الأسماك التي خضعت لتلاعبات جينية أو دوائية مختلفة18. وعموما، هذه المزايا تجعل الفاصل الزمني في التصوير البؤري في الجسم الحي من Brainbow التعبير عن سمك الحمار الوحشي مثالية للباحثين استكشاف تطوير الجهاز العصبي الفقارية، ولا سيما المهتمين في دور استنساخ.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول طريقة لتصور استنساخ الخلايا السلف والخلايا العصبية في الدماغ الخلفي الحمار الوحشي النامية ومتابعتها في الجسم الحي باستخدام Brainbow والوقت الفاصل المجهر11. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول بالمقارنة مع في المختبر أو الدراسات الحمراء السابقة هي القدرة على مرا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ي. أ. بان، ج. لايفت وز. توبياس على المساهمات التقنية والفكرية. وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم (الجائزة 1553764) وصندوق M.J. Murdock الخيري.
Materials
| 1.5mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 134020 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation |
| 50ml conical tubes | Corning | 352070 | For heat shocking embryos |
| 6 lb nylon fishing line | SecureLine | NMT250 | For making embryo manipulators |
| 7.5mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 135010 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | For E3 |
| Cotton swabs | Puritan | 867-WC NO GLUE | For making embryo manipulators |
| Cre recombinase | New England Biolabs | M0298M | |
| Digital dry bath | Genemate | 490016-616 | Used to store LMA at 40°C |
| Epifluorescence dissection scope | |||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Incubator | Forma Scientific | 3158 | To maintain embryos at 28°C |
| Injection plate molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Isotemp water bath | Fisher Scientific | 2320 | For heat shocking embryos |
| KCl | AMRESCO | 0395 | For E3 and for DNA solution for injections |
| Laser-scanning confocal microscope | Zeiss | LSM710 | |
| LE agarose | Genemate | E3120 | To create agarose injection plates |
| Low-melt agarose (LMA) | AMRESCO | J234 | |
| Mating tanks | Aquaneering, Inc. | ZHCT100 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | For E3 |
| MgSO4 | Sigma | 9397 | For E3 |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| MS-222 Tricaine-S | Western Chemical, Inc. | Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | For E3 |
| Petri dishes (90 mm, 60 mm) | Genesee Scientific | 32-107G | To house embryos and create imaging chamber (60 mm) |
| Phenol red | Sigma | P0290 | |
| Soft stitch ring markers | Clover Needlecraft, Inc. | 354 | For creating imaging chamber with Petri dish |
| Super glue (Ultra gel control) | Loctite | 1363589 | For making embryo manipulators |
| Syringe needles | Beckton Dickinson | BD329412 | For dechorionating embryos |
References
- Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
- Mcconnell, S. K. Constructing the Cerebral Cortex: Neurogenesis and Fate Determination Review. Neuron. 15, 761-768 (1995).
- Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish – from embryo to adult. Neural Development. 8, 3 (2013).
- Chenn, A., Walsh, C. Regulation of Cerebral Cortical Size by Control of Cell Cycle Exit in Neural Precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and Evolution of the Human Neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32, 1817-1828 (2013).
- Homem, C. C. F., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nature Reviews Neuroscience. 16 (11), 647-659 (2015).
- Brockway, N. L., et al. Multicolor lineage tracing using in vivo time-lapse imaging reveals coordinated death of clonally related cells in the developing vertebrate brain. Developmental Biology. 453 (2), 130-140 (2019).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
- Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Ko, S. K., Chen, X., Yoon, J., Shin, I. Zebrafish as a good vertebrate model for molecular imaging using fluorescent probes. Chemical Society Reviews. 40, 2120 (2011).
- Kesavan, G., Hammer, J., Hans, S., Brand, M. Targeted knock-in of CreERT2 in zebrafish using CRISPR/Cas9. Cell and Tissue Research. 372, 41-50 (2018).
- Cook, Z. T., et al. Combining near-infrared fluorescence with Brainbow to visualize expression of specific genes within a multicolor context. Molecular Biology of the Cell. 30 (4), 491-505 (2019).
- Kuwata, M., Nikaido, M., Hatta, K. Local heat-shock mediated multi-color labeling visualizing behaviors of enteric neural crest cells associated with division and neurogenesis in zebrafish gut. Developmental Dynamics. 248, 437-448 (2019).
- Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (3), 1164-1169 (2011).
- Heap, L. A., Goh, C. C., Kassahn, K. S., Scott, E. K. Cerebellar Output in Zebrafish: An Analysis of Spatial Patterns and Topography in Eurydendroid Cell Projections. Frontiers in Neural Circuits. 7, 53 (2013).
- Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise Lamination of Retinal Axons Generates Multiple Parallel Input Pathways in the Tectum. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
- Dirian, L., et al. Spatial Regionalization and Heterochrony in the Formation of Adult Pallial Neural Stem Cells. Developmental Cell. 30, 123-136 (2014).
- Chen, X. A., et al. Behavioral/Cognitive QRFP and Its Receptors Regulate Locomotor Activity and Sleep in Zebrafish. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1823-1840 (2016).
- Albadri, S., De Santis, F., Di Donato, V., Del Bene, F., Jaenisch, R., Zhang, F., Gage, F. CRISPR/Cas9-Mediated Knockin and Knockout in Zebrafish. Genome Editing in Neurosciences. , 41-49 (2017).
- Furlan, G., et al. Life-Long Neurogenic Activity of Individual Neural Stem Cells and Continuous Growth Establish an Outside-In Architecture in the Teleost Pallium. Current Biology. 27, 3288-3301 (2017).
- Herget, U., Arturo Gutierrez-Triana, J., Salazar Thula, O., Knerr, B., Ryu, S. Single-cell reconstruction of oxytocinergic neurons reveals separate hypophysiotropic and encephalotropic subtypes in larval zebrafish Brainbow-guided morphology of oxytocinergic cells. eNeuro. 4 (1), (2017).
- Halloran, M. C., et al. Laser-targeted gene expression. Development. 127, 1953-1960 (2000).
- Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50, 401-406 (2008).
- Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a Recombinant Retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
- Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104, 473-482 (1988).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-441 (1992).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Clonal dispersion in proliferative layers of developing cerebral cortex. Nature. 362 (6421), 632-635 (1993).
- Cai, L., Hayes, N. L., Nowakowski, R. S. Synchrony of Clonal Cell Proliferation and Contiguity of Clonally Related Cells: Production of Mosaicism in the Ventricular Zone of Developing Mouse Neocortex. The Journal of Neuroscience. 17 (6), 2088-2100 (1997).
- Reznikov, K., Acklin, S. E., Van Der Kooy, D. Clonal Heterogeneity in the Early Embryonic Rodent Cortical Germinal Zone and the Separation of Subventricular From Ventricular Zone Lineages. Developmental Dynamics. 210, 328-343 (1997).
- Qian, X., Goderie, S., Shen, Q., Stern, J., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125, 3143-3152 (1998).
- McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic Neural Progenitors Appear to Be Restricted to Regional and Glial Fates before the Onset of Neurogenesis. The Journal of Neuroscience. 21 (17), 6772-6781 (2001).
- Yu, Y. C., Bultje, R. S., Wang, X., Shi, S. H. Specific synapses develop preferentially among sister excitatory neurons in the neocortex. Nature. 458 (7237), 501-504 (2009).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish Breeding in the Laboratory Environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. 25, e1115 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- R Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2017).
- Smith, M. R. . Ternary: an R package to generate ternary plots. , (2017).
- Baye, L. M., Link, B. A. Development/Plasticity/Repair Interkinetic Nuclear Migration and the Selection of Neurogenic Cell Divisions during Vertebrate Retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
- Leung, L., Klopper, A. V., Grill, S. W., Harris, W. A., Norden, C. Apical migration of nuclei during G2 is a prerequisite for all nuclear motion in zebrafish neuroepithelia. Development. 139, 2635 (2012).
- Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H., Curriet, A. R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wide-ranging Implications in Tissue Kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239 (1972).
- Cole, L. K., Ross, L. S. Apoptosis in the Developing Zebrafish Embryo. Developmental Biology. 240, 123-142 (2001).
- Liao, J., He, J., Yan, T., Korzh, V., Gong, Z. A Class of NeuroD-Related Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Expressed in Developing Central Nervous System in Zebrafish. DNA and Cell Biology. 18 (4), 333-344 (1999).
- Trevarrow, B., Marks, D. L., Kimmel, C. B. Organization of hindbrain segments in the zebrafish embryo. Neuron. 4 (5), 669-679 (1990).
- Yabu, T., Todoriki, S., Yamashita, M. Stress-induced apoptosis by heat shock, UV and gamma-ray irradiation in zebrafish embryos detected by increased caspase activity and whole-mount TUNEL staining. Fisheries Science. 67, 333-340 (2001).
