Визуализация развивающегося мозга в жизни зебрафиш с помощью Brainbow и замедленного Confocal imaging
Summary
In vivo изображение является мощным инструментом, который может быть использован для исследования клеточных механизмов, лежащих в основе развития нервной системы. Здесь мы описываем метод использования замедленной конфокальной микроскопии для визуализации большого количества многоцветных Brainbow-маркированных клеток в режиме реального времени в развивающейся нервной системе зебры.
Abstract
Развитие позвоночной нервной системы требует точной координации сложного клеточного поведения и взаимодействий. Использование методов визуализации с высоким разрешением vivo может обеспечить четкое окно в эти процессы в живом организме. Например, за делением клеток и их потомством можно следовать в режиме реального времени по мере образования нервной системы. В последние годы технические достижения в области многоцветных методов расширили типы вопросов, которые могут быть исследованы. Многоцветный подход Brainbow может быть использован не только для различения между подобными клетками, но и для цветового кода нескольких различных клонов родственных клеток, каждый из которых происходит из одной клетки-прародителя. Это позволяет мультиплекс линии анализа многих различных клонов и их поведения одновременно во время разработки. Здесь мы описываем метод использования замедленной конфокальной микроскопии для визуализации большого количества многоцветных Brainbow-маркированных клеток в реальном времени в развивающейся нервной системе зебры. Это особенно полезно для следующих клеточных взаимодействий между клетками, которые трудно обозначить дифференциально с помощью традиционных промоутер-управляемых цветов. Наш подход может быть использован для отслеживания отношений линии между несколькими различными клонами одновременно. Большие наборы данных, генерируемые с помощью этого метода, предоставляют богатую информацию, которую можно количественно сравнить с генетическими или фармакологическими манипуляциями. В конечном счете полученные результаты могут помочь ответить на систематические вопросы о том, как развивается нервная система.
Introduction
На ранних стадиях развития пулы специализированных клеток-прародителей делятся повторно в пролиферативных зонах, производя различные массивы дочерческих клеток. Клетки, рожденные в течение этого периода развития, затем дифференцируются и путешествуют, чтобы сформировать зарождающиеся органы. В нервной системе, прародители, такие как радиальная глия привести к незрелых нейронов в желудочковых зонах. По мере того как нейроны мигрируют от желудочков и созревают, расширяющаяся ткань в конечном итоге образует очень сложные структуры мозга1,,2,,33,44,6,. Координация между декорациями и дифференциации и миграции нейронов будет определять возможный размер, форму, и, следовательно, функции мозга, непосредственно влияющих на поведение7,8,9,10. Хотя жесткий контроль над этими процессами, безусловно, имеет решающее значение для нормального развития мозга, глобальные механизмы, которые регулируют эти динамики, не очень хорошо изучены. Здесь мы описываем инструмент для изучения развития нервной системы в клеточном разрешении, что позволяет исследователям визуализировать клетки-прародителя и нейроны in vivo в развивающемся мозге зебры с Brainbow и отслеживать их поведение с течением времени с помощью замедленной конфокальной микроскопии11. Этот подход также может быть адаптирован для визуализации других частей развивающегося эмбриона.
Чтобы наблюдать и различать среди клеток в развивающемся мозге зебры, мы адаптировали метод маркировки клеток Brainbow11. Brainbow использует случайно определенные, комбинаторные выражения трех различных флуоресцентных белков (FPs) для обозначения популяции клеток. В то время как выражение мракли иэкспрессии по умолчанию для экспрессии Brainbow является красным FP dTomato, рекомбинация фермента Cre recombinase приводит к экспрессии мцерулеана (циановый флуоресцентный белок, CFP) или желтый флуоресцентный белок (YFP)12,13. Совокупное количество каждого FP, выраженное в ячейке, придает ему уникальный оттенок, позволяющий четко ею визуальное различие с соседними клетками. Кроме того, когда клетка-прародитель делится, каждая клетка дочери унаследует цвет от своей материнской клетки, производя цветные клоны и позволяя исследователям отслеживать линию клеток11,14. Хотя первоначально используется для анализа нейронных схем у мышей12, Brainbow с тех пор было выражено в широком спектре типовых организмов, в том числе зебрафиш15.
Наша техника основывается на предыдущих методах многоцветной маркировки и визуализации, чтобы непосредственно изображения нескольких цветовых клонов с течением времени в живых зебры. Из-за их оптической прозрачности, как эмбрионы, зебра хорошо подходит для визуализации экспериментов16, и предыдущие исследования использовали Brainbow в зебры для изучения различных тканей, в том числе нервной системы11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Способность непосредственно к изображению в живой организм, наряду с их быстрым развитием экс-утробы, делают зебры ценной моделью развития позвоночных. В отличие от мозга млекопитающих, вся пролиферативная зона заднего мозга зебры легко доступна для визуализации без нарушения его эндогенной среды6. Это позволяет проводить эксперименты в живом организме, а не в экстракорпорированных или стационарных препаратах тканей. В отличие от экспериментов с фиксированной визуализацией, исследования in vivo позволяют продольную конструкцию, производя многочасовые данные, которые могут быть проанализированы на модели, тем самым увеличивая вероятность наблюдения относительно редких событий. В зависимости от скорости и длины событий, представляющих интерес, исследователи могут выбрать для выполнения коротких (1-2 ч) или длинные (до 16 ч) эксперименты по визуализации по времени. С помощью зебры теплового шока промоутер 70 (hsp70, hsp), Brainbow выражение может быть временно контролируется28,29. Кроме того, мозаика выражение индуцированных этот промоутер хорошо подходит для маркировки и отслеживания многих клонов11.
Способность визуально идентифицировать несколько клонов в живом мозге является преимуществом этого метода. Важные предыдущие исследования, которые исследовали роль клонов в развитии нервной системы использовали ретровирусные векторы для обозначения одной клетки-прародителя и ее потомства с помощью одного FP или другого легко визуализированного белка. Такая маркировка позволяет исследователям наблюдать один клон с течением времени, либо in vitro или in vivo22,30,,31,,32,,33,,34,,35,,36,,37,,38. В отличие от методов отслеживания поведения клеток в пределах одного клона, различные цвета Brainbow позволяют исследователям наблюдать динамику среди клонов. Кроме того, с помощью Brainbow для обозначения многих клонов в головном мозге, дополнительные данные о клональном поведении собираются по отношению к методам, которые маркировать один клон11. Важно отметить, что описанные здесь подходы могут быть расширены для создания сравнения развития между рыбами, которые подверглись различным генетическим или фармакологическим манипуляциям18. В целом, эти преимущества делают промежуток времени в vivo confocal изображения Brainbow-выражения зебры идеально подходит для исследователей, исследующих развитие позвоночной нервной системы, особенно тех, кто заинтересован в роли клонов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает метод визуализации клонов клеток-прародителей и нейронов в развивающихся задней мозг зебры и следовать за ними in vivo с помощью Brainbow и замедленной конфокальной микроскопии11. Основным преимуществом этого протокола по сравнению с исследованиями in vitro …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Я. А. Пана, Дж. Ливета и З. Тобиаса за технический и интеллектуальный вклад. Эта работа была поддержана Национальным научным фондом (Премия 1553764) и Благотворительным фондом М.Д. Мердока.
Materials
| 1.5mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 134020 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation |
| 50ml conical tubes | Corning | 352070 | For heat shocking embryos |
| 6 lb nylon fishing line | SecureLine | NMT250 | For making embryo manipulators |
| 7.5mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 135010 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | For E3 |
| Cotton swabs | Puritan | 867-WC NO GLUE | For making embryo manipulators |
| Cre recombinase | New England Biolabs | M0298M | |
| Digital dry bath | Genemate | 490016-616 | Used to store LMA at 40°C |
| Epifluorescence dissection scope | |||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Incubator | Forma Scientific | 3158 | To maintain embryos at 28°C |
| Injection plate molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Isotemp water bath | Fisher Scientific | 2320 | For heat shocking embryos |
| KCl | AMRESCO | 0395 | For E3 and for DNA solution for injections |
| Laser-scanning confocal microscope | Zeiss | LSM710 | |
| LE agarose | Genemate | E3120 | To create agarose injection plates |
| Low-melt agarose (LMA) | AMRESCO | J234 | |
| Mating tanks | Aquaneering, Inc. | ZHCT100 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | For E3 |
| MgSO4 | Sigma | 9397 | For E3 |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| MS-222 Tricaine-S | Western Chemical, Inc. | Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | For E3 |
| Petri dishes (90 mm, 60 mm) | Genesee Scientific | 32-107G | To house embryos and create imaging chamber (60 mm) |
| Phenol red | Sigma | P0290 | |
| Soft stitch ring markers | Clover Needlecraft, Inc. | 354 | For creating imaging chamber with Petri dish |
| Super glue (Ultra gel control) | Loctite | 1363589 | For making embryo manipulators |
| Syringe needles | Beckton Dickinson | BD329412 | For dechorionating embryos |
References
- Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
- Mcconnell, S. K. Constructing the Cerebral Cortex: Neurogenesis and Fate Determination Review. Neuron. 15, 761-768 (1995).
- Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish – from embryo to adult. Neural Development. 8, 3 (2013).
- Chenn, A., Walsh, C. Regulation of Cerebral Cortical Size by Control of Cell Cycle Exit in Neural Precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and Evolution of the Human Neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32, 1817-1828 (2013).
- Homem, C. C. F., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nature Reviews Neuroscience. 16 (11), 647-659 (2015).
- Brockway, N. L., et al. Multicolor lineage tracing using in vivo time-lapse imaging reveals coordinated death of clonally related cells in the developing vertebrate brain. Developmental Biology. 453 (2), 130-140 (2019).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
- Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Ko, S. K., Chen, X., Yoon, J., Shin, I. Zebrafish as a good vertebrate model for molecular imaging using fluorescent probes. Chemical Society Reviews. 40, 2120 (2011).
- Kesavan, G., Hammer, J., Hans, S., Brand, M. Targeted knock-in of CreERT2 in zebrafish using CRISPR/Cas9. Cell and Tissue Research. 372, 41-50 (2018).
- Cook, Z. T., et al. Combining near-infrared fluorescence with Brainbow to visualize expression of specific genes within a multicolor context. Molecular Biology of the Cell. 30 (4), 491-505 (2019).
- Kuwata, M., Nikaido, M., Hatta, K. Local heat-shock mediated multi-color labeling visualizing behaviors of enteric neural crest cells associated with division and neurogenesis in zebrafish gut. Developmental Dynamics. 248, 437-448 (2019).
- Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (3), 1164-1169 (2011).
- Heap, L. A., Goh, C. C., Kassahn, K. S., Scott, E. K. Cerebellar Output in Zebrafish: An Analysis of Spatial Patterns and Topography in Eurydendroid Cell Projections. Frontiers in Neural Circuits. 7, 53 (2013).
- Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise Lamination of Retinal Axons Generates Multiple Parallel Input Pathways in the Tectum. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
- Dirian, L., et al. Spatial Regionalization and Heterochrony in the Formation of Adult Pallial Neural Stem Cells. Developmental Cell. 30, 123-136 (2014).
- Chen, X. A., et al. Behavioral/Cognitive QRFP and Its Receptors Regulate Locomotor Activity and Sleep in Zebrafish. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1823-1840 (2016).
- Albadri, S., De Santis, F., Di Donato, V., Del Bene, F., Jaenisch, R., Zhang, F., Gage, F. CRISPR/Cas9-Mediated Knockin and Knockout in Zebrafish. Genome Editing in Neurosciences. , 41-49 (2017).
- Furlan, G., et al. Life-Long Neurogenic Activity of Individual Neural Stem Cells and Continuous Growth Establish an Outside-In Architecture in the Teleost Pallium. Current Biology. 27, 3288-3301 (2017).
- Herget, U., Arturo Gutierrez-Triana, J., Salazar Thula, O., Knerr, B., Ryu, S. Single-cell reconstruction of oxytocinergic neurons reveals separate hypophysiotropic and encephalotropic subtypes in larval zebrafish Brainbow-guided morphology of oxytocinergic cells. eNeuro. 4 (1), (2017).
- Halloran, M. C., et al. Laser-targeted gene expression. Development. 127, 1953-1960 (2000).
- Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50, 401-406 (2008).
- Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a Recombinant Retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
- Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104, 473-482 (1988).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-441 (1992).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Clonal dispersion in proliferative layers of developing cerebral cortex. Nature. 362 (6421), 632-635 (1993).
- Cai, L., Hayes, N. L., Nowakowski, R. S. Synchrony of Clonal Cell Proliferation and Contiguity of Clonally Related Cells: Production of Mosaicism in the Ventricular Zone of Developing Mouse Neocortex. The Journal of Neuroscience. 17 (6), 2088-2100 (1997).
- Reznikov, K., Acklin, S. E., Van Der Kooy, D. Clonal Heterogeneity in the Early Embryonic Rodent Cortical Germinal Zone and the Separation of Subventricular From Ventricular Zone Lineages. Developmental Dynamics. 210, 328-343 (1997).
- Qian, X., Goderie, S., Shen, Q., Stern, J., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125, 3143-3152 (1998).
- McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic Neural Progenitors Appear to Be Restricted to Regional and Glial Fates before the Onset of Neurogenesis. The Journal of Neuroscience. 21 (17), 6772-6781 (2001).
- Yu, Y. C., Bultje, R. S., Wang, X., Shi, S. H. Specific synapses develop preferentially among sister excitatory neurons in the neocortex. Nature. 458 (7237), 501-504 (2009).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish Breeding in the Laboratory Environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. 25, e1115 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- R Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2017).
- Smith, M. R. . Ternary: an R package to generate ternary plots. , (2017).
- Baye, L. M., Link, B. A. Development/Plasticity/Repair Interkinetic Nuclear Migration and the Selection of Neurogenic Cell Divisions during Vertebrate Retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
- Leung, L., Klopper, A. V., Grill, S. W., Harris, W. A., Norden, C. Apical migration of nuclei during G2 is a prerequisite for all nuclear motion in zebrafish neuroepithelia. Development. 139, 2635 (2012).
- Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H., Curriet, A. R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wide-ranging Implications in Tissue Kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239 (1972).
- Cole, L. K., Ross, L. S. Apoptosis in the Developing Zebrafish Embryo. Developmental Biology. 240, 123-142 (2001).
- Liao, J., He, J., Yan, T., Korzh, V., Gong, Z. A Class of NeuroD-Related Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Expressed in Developing Central Nervous System in Zebrafish. DNA and Cell Biology. 18 (4), 333-344 (1999).
- Trevarrow, B., Marks, D. L., Kimmel, C. B. Organization of hindbrain segments in the zebrafish embryo. Neuron. 4 (5), 669-679 (1990).
- Yabu, T., Todoriki, S., Yamashita, M. Stress-induced apoptosis by heat shock, UV and gamma-ray irradiation in zebrafish embryos detected by increased caspase activity and whole-mount TUNEL staining. Fisheries Science. 67, 333-340 (2001).
