Visualizando o cérebro em desenvolvimento em zebrafish vivo usando Brainbow e Imagem Confocal de lapso de tempo
Summary
A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para investigar os mecanismos celulares subjacentes ao desenvolvimento do sistema nervoso. Aqui descrevemos uma técnica para usar microscopia confocal de lapso de tempo para visualizar um grande número de células multicoloridas com rótulo barco-íris em tempo real dentro do sistema nervoso zebrafish em desenvolvimento.
Abstract
O desenvolvimento do sistema nervoso vertebrado requer uma coordenação precisa de comportamentos e interações celulares complexos. O uso de técnicas de imagem in vivo de alta resolução pode fornecer uma janela clara para esses processos no organismo vivo. Por exemplo, a divisão de células e sua descendência pode ser seguida em tempo real à medida que o sistema nervoso se forma. Nos últimos anos, os avanços técnicos em técnicas multicoloridas têm ampliado os tipos de questões que podem ser investigadas. A abordagem multicolor Brainbow pode ser usada não apenas para distinguir entre células semelhantes, mas também para codificar vários clones diferentes de células relacionadas que cada um deriva de uma célula progenitora. Isso permite uma análise de linhagem multiplex de muitos clones diferentes e seus comportamentos simultaneamente durante o desenvolvimento. Aqui descrevemos uma técnica para usar microscopia confocal de lapso de tempo para visualizar um grande número de células multicoloridas com rótulo sarco-íris ao longo do tempo real dentro do sistema nervoso zebrafish em desenvolvimento. Isso é particularmente útil para acompanhar interações celulares entre células como células, que são difíceis de rotular diferencialmente usando cores tradicionais orientadas por promotores. Nossa abordagem pode ser usada para rastrear relações de linhagem entre vários clones diferentes simultaneamente. Os grandes conjuntos de dados gerados com essa técnica fornecem informações ricas que podem ser comparadas quantitativamente entre manipulações genéticas ou farmacológicas. Em última análise, os resultados gerados podem ajudar a responder perguntas sistemáticas sobre como o sistema nervoso se desenvolve.
Introduction
Nas fases iniciais do desenvolvimento, grupos de células progenitoras especializadas se dividem repetidamente em zonas proliferativas, produzindo diversos conjuntos de células filhas. As células nascidas durante esse período de desenvolvimento se diferenciarão e viajarão para formar os órgãos nascentes. No sistema nervoso, progenitores como glia radial dão origem a neurônios imaturos em zonas ventriculares. À medida que os neurônios migram para longe dos ventrículos e amadurecem, o tecido em expansão eventualmente forma as estruturas altamente complexas do cérebro11,2,,3,4,5,6. A coordenação entre divisão de progenitores e diferenciação e migração de neurônios determinará o tamanho, a forma e, portanto, a função do cérebro, impactando diretamente o comportamento7,,8,,9,,10. Embora o controle rigoroso sobre esses processos seja claramente crucial para o desenvolvimento normal do cérebro, os mecanismos globais que regulam essas dinâmicas não são bem compreendidos. Aqui descrevemos uma ferramenta para estudar o desenvolvimento do sistema nervoso em uma resolução celular, permitindo que os pesquisadores visualizem células progenitoras e neurônios in vivo no cérebro de zebrafish em desenvolvimento com Brainbow e acompanhem seu comportamento ao longo do tempo através da microscopia confocal de lapso de tempo11. A abordagem também pode ser adaptada para visualizar outras partes do embrião em desenvolvimento.
Para observar e distinguir entre as células no cérebro de zebrafish em desenvolvimento, adaptamos a técnica de rotulagem celular Brainbow11. Brainbow utiliza a expressão combinada e determinada aleatoriamente de três proteínas fluorescentes distintas (FPs) para rotular uma população de células. Enquanto a expressão padrão para expressão Brainbow é o fp dTomato vermelho, a recombinação pela enzima Cre recombinase resulta na expressão de mCerulean (proteína fluorescente de ciano, CFP) ou proteína fluorescente amarela (YFP)12,13. A quantidade combinada de cada FP expressa em uma célula lhe dá uma tonalidade única, permitindo uma clara distinção visual das células vizinhas. Além disso, quando uma célula progenitora se divide, cada célula filha herdará a cor de sua célula mãe, produzindo clones codificados por cores e permitindo que os pesquisadores rastreiem a linhagem celular11,14. Embora originalmente usado para analisar circuitos neuronais em camundongos12, Brainbow tem sido expresso em uma grande variedade de organismos modelo, incluindo zebrafish15.
Nossa técnica se baseia em métodos anteriores de rotulagem e imagem multicoloridas para visualizar diretamente vários clones codificados por cores ao longo do tempo em zebrafish vivos. Devido à sua transparência óptica como embriões, os zebrafish são adequados para experimentos de imagem16, e estudos anteriores têm utilizado brainbow em zebrafish para estudar uma variedade de tecidos, incluindo o sistema nervoso11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. A capacidade de imaginar diretamente o organismo vivo, juntamente com seu rápido desenvolvimento ex-utero, fazem do zebrafish um modelo valioso de desenvolvimento de vertebrados. Em contraste com o cérebro mamífero, toda a zona proliferativa do cérebro-zebrafish está prontamente disponível para imagens sem interrupção em seu ambiente endógeno6. Isso permite que experimentos sejam realizados no organismo vivo, em vez de preparações de tecidos in vitro ou fixos. Em contraste com os experimentos de imagem fixa, estudos in vivo permitem um desenho longitudinal, produzindo horas de dados que podem ser analisados para padrões, aumentando assim a probabilidade de observação de eventos relativamente raros. Dependendo da velocidade e duração dos eventos de interesse, os pesquisadores podem optar por realizar experimentos de imagem curtos (1-2 h) ou longos (até ~16 h). Usando o promotor de choque térmico de zebrafish 70 (hsp70, hsp), a expressão brainbow pode ser controlada temporalmente28,29. Além disso, a expressão de mosaico induzida por este promotor é adequada para rotular e rastrear muitos clones11.
A capacidade de identificar visualmente múltiplos clones dentro do cérebro vivo é uma vantagem deste método. Importantes estudos anteriores que investigaram o papel dos clones no desenvolvimento do sistema nervoso utilizaram vetores retrovirais para rotular uma única célula progenitora e sua descendência usando um único FP ou outra proteína prontamente visualizada. Essa rotulagem permite que os pesquisadores observem um único clone ao longo do tempo, seja in vitro ou in vivo2,,30,,31,,32,,33,,34,,35,,36,,37,,38. Em contraste com os métodos para rastrear o comportamento das células dentro de um clone, as cores distintas do Brainbow permitem que os pesquisadores observem a dinâmica entre os clones. Além disso, usando o Brainbow para rotular muitos clones dentro do cérebro, dados adicionais sobre o comportamento clonal são coletados em relação às técnicas que rotulam um único clone11. É importante ressaltar que as abordagens aqui descritas podem ser ampliadas para gerar comparações de desenvolvimento entre peixes submetidos a diferentes manipulações genéticas ou farmacológicas18. No geral, essas vantagens tornam o lapso de tempo em imagens confocais de zebrafish expressos em Brainbow ideais para pesquisadores que exploram o desenvolvimento do sistema nervoso vertebrado, particularmente aqueles interessados no papel dos clones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve um método para visualizar clones de células progenitoras e neurônios no cérebro-zebrafish em desenvolvimento e segui-los in vivo usando Brainbow e microscopia confocal de lapso de tempo11. A principal vantagem deste protocolo em comparação com estudos in vitro ou ex vivo é a capacidade de observar diretamente a zona proliferativa do cérebro vertebrado em seu meio natural ao longo do tempo. Esta técnica baseia-se em estudos anteriores que rotularam um único clone u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Y. A. Pan, J. Livet e Z. Tobias por contribuições técnicas e intelectuais. Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation (Prêmio 1553764) e pelo M.J. Murdock Charitable Trust.
Materials
| 1.5mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 134020 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation |
| 50ml conical tubes | Corning | 352070 | For heat shocking embryos |
| 6 lb nylon fishing line | SecureLine | NMT250 | For making embryo manipulators |
| 7.5mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 135010 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | For E3 |
| Cotton swabs | Puritan | 867-WC NO GLUE | For making embryo manipulators |
| Cre recombinase | New England Biolabs | M0298M | |
| Digital dry bath | Genemate | 490016-616 | Used to store LMA at 40°C |
| Epifluorescence dissection scope | |||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Incubator | Forma Scientific | 3158 | To maintain embryos at 28°C |
| Injection plate molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Isotemp water bath | Fisher Scientific | 2320 | For heat shocking embryos |
| KCl | AMRESCO | 0395 | For E3 and for DNA solution for injections |
| Laser-scanning confocal microscope | Zeiss | LSM710 | |
| LE agarose | Genemate | E3120 | To create agarose injection plates |
| Low-melt agarose (LMA) | AMRESCO | J234 | |
| Mating tanks | Aquaneering, Inc. | ZHCT100 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | For E3 |
| MgSO4 | Sigma | 9397 | For E3 |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| MS-222 Tricaine-S | Western Chemical, Inc. | Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | For E3 |
| Petri dishes (90 mm, 60 mm) | Genesee Scientific | 32-107G | To house embryos and create imaging chamber (60 mm) |
| Phenol red | Sigma | P0290 | |
| Soft stitch ring markers | Clover Needlecraft, Inc. | 354 | For creating imaging chamber with Petri dish |
| Super glue (Ultra gel control) | Loctite | 1363589 | For making embryo manipulators |
| Syringe needles | Beckton Dickinson | BD329412 | For dechorionating embryos |
References
- Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
- Mcconnell, S. K. Constructing the Cerebral Cortex: Neurogenesis and Fate Determination Review. Neuron. 15, 761-768 (1995).
- Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish – from embryo to adult. Neural Development. 8, 3 (2013).
- Chenn, A., Walsh, C. Regulation of Cerebral Cortical Size by Control of Cell Cycle Exit in Neural Precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and Evolution of the Human Neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32, 1817-1828 (2013).
- Homem, C. C. F., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nature Reviews Neuroscience. 16 (11), 647-659 (2015).
- Brockway, N. L., et al. Multicolor lineage tracing using in vivo time-lapse imaging reveals coordinated death of clonally related cells in the developing vertebrate brain. Developmental Biology. 453 (2), 130-140 (2019).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
- Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Ko, S. K., Chen, X., Yoon, J., Shin, I. Zebrafish as a good vertebrate model for molecular imaging using fluorescent probes. Chemical Society Reviews. 40, 2120 (2011).
- Kesavan, G., Hammer, J., Hans, S., Brand, M. Targeted knock-in of CreERT2 in zebrafish using CRISPR/Cas9. Cell and Tissue Research. 372, 41-50 (2018).
- Cook, Z. T., et al. Combining near-infrared fluorescence with Brainbow to visualize expression of specific genes within a multicolor context. Molecular Biology of the Cell. 30 (4), 491-505 (2019).
- Kuwata, M., Nikaido, M., Hatta, K. Local heat-shock mediated multi-color labeling visualizing behaviors of enteric neural crest cells associated with division and neurogenesis in zebrafish gut. Developmental Dynamics. 248, 437-448 (2019).
- Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (3), 1164-1169 (2011).
- Heap, L. A., Goh, C. C., Kassahn, K. S., Scott, E. K. Cerebellar Output in Zebrafish: An Analysis of Spatial Patterns and Topography in Eurydendroid Cell Projections. Frontiers in Neural Circuits. 7, 53 (2013).
- Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise Lamination of Retinal Axons Generates Multiple Parallel Input Pathways in the Tectum. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
- Dirian, L., et al. Spatial Regionalization and Heterochrony in the Formation of Adult Pallial Neural Stem Cells. Developmental Cell. 30, 123-136 (2014).
- Chen, X. A., et al. Behavioral/Cognitive QRFP and Its Receptors Regulate Locomotor Activity and Sleep in Zebrafish. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1823-1840 (2016).
- Albadri, S., De Santis, F., Di Donato, V., Del Bene, F., Jaenisch, R., Zhang, F., Gage, F. CRISPR/Cas9-Mediated Knockin and Knockout in Zebrafish. Genome Editing in Neurosciences. , 41-49 (2017).
- Furlan, G., et al. Life-Long Neurogenic Activity of Individual Neural Stem Cells and Continuous Growth Establish an Outside-In Architecture in the Teleost Pallium. Current Biology. 27, 3288-3301 (2017).
- Herget, U., Arturo Gutierrez-Triana, J., Salazar Thula, O., Knerr, B., Ryu, S. Single-cell reconstruction of oxytocinergic neurons reveals separate hypophysiotropic and encephalotropic subtypes in larval zebrafish Brainbow-guided morphology of oxytocinergic cells. eNeuro. 4 (1), (2017).
- Halloran, M. C., et al. Laser-targeted gene expression. Development. 127, 1953-1960 (2000).
- Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50, 401-406 (2008).
- Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a Recombinant Retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
- Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104, 473-482 (1988).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-441 (1992).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Clonal dispersion in proliferative layers of developing cerebral cortex. Nature. 362 (6421), 632-635 (1993).
- Cai, L., Hayes, N. L., Nowakowski, R. S. Synchrony of Clonal Cell Proliferation and Contiguity of Clonally Related Cells: Production of Mosaicism in the Ventricular Zone of Developing Mouse Neocortex. The Journal of Neuroscience. 17 (6), 2088-2100 (1997).
- Reznikov, K., Acklin, S. E., Van Der Kooy, D. Clonal Heterogeneity in the Early Embryonic Rodent Cortical Germinal Zone and the Separation of Subventricular From Ventricular Zone Lineages. Developmental Dynamics. 210, 328-343 (1997).
- Qian, X., Goderie, S., Shen, Q., Stern, J., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125, 3143-3152 (1998).
- McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic Neural Progenitors Appear to Be Restricted to Regional and Glial Fates before the Onset of Neurogenesis. The Journal of Neuroscience. 21 (17), 6772-6781 (2001).
- Yu, Y. C., Bultje, R. S., Wang, X., Shi, S. H. Specific synapses develop preferentially among sister excitatory neurons in the neocortex. Nature. 458 (7237), 501-504 (2009).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish Breeding in the Laboratory Environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. 25, e1115 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- R Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2017).
- Smith, M. R. . Ternary: an R package to generate ternary plots. , (2017).
- Baye, L. M., Link, B. A. Development/Plasticity/Repair Interkinetic Nuclear Migration and the Selection of Neurogenic Cell Divisions during Vertebrate Retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
- Leung, L., Klopper, A. V., Grill, S. W., Harris, W. A., Norden, C. Apical migration of nuclei during G2 is a prerequisite for all nuclear motion in zebrafish neuroepithelia. Development. 139, 2635 (2012).
- Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H., Curriet, A. R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wide-ranging Implications in Tissue Kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239 (1972).
- Cole, L. K., Ross, L. S. Apoptosis in the Developing Zebrafish Embryo. Developmental Biology. 240, 123-142 (2001).
- Liao, J., He, J., Yan, T., Korzh, V., Gong, Z. A Class of NeuroD-Related Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Expressed in Developing Central Nervous System in Zebrafish. DNA and Cell Biology. 18 (4), 333-344 (1999).
- Trevarrow, B., Marks, D. L., Kimmel, C. B. Organization of hindbrain segments in the zebrafish embryo. Neuron. 4 (5), 669-679 (1990).
- Yabu, T., Todoriki, S., Yamashita, M. Stress-induced apoptosis by heat shock, UV and gamma-ray irradiation in zebrafish embryos detected by increased caspase activity and whole-mount TUNEL staining. Fisheries Science. 67, 333-340 (2001).
