Brainbow ve Time-lapse Konfokal Görüntüleme kullanarak Yaşayan Zebrabalıklarında Gelişen Beyni Görselleştirme
Summary
In vivo görüntüleme sinir sistemi gelişiminin altında yatan hücresel mekanizmaları araştırmak için kullanılabilecek güçlü bir araçtır. Burada, gelişmekte olan zebra balığı sinir sistemi içinde çok renkli Brainbow etiketli çok sayıda hücreyi gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için zaman atlamalı konfokal mikroskopiyi kullanma tekniğini açıklıyoruz.
Abstract
Omurgalı sinir sisteminin gelişimi karmaşık hücresel davranışlar ve etkileşimlerin hassas bir koordinasyon gerektirir. Vivo görüntüleme tekniklerinde yüksek çözünürlüklü kullanımı, canlı organizmada bu süreçlere açık bir pencere açabilir. Örneğin, hücreleri ve bunların dölleri sinir sistemi formları olarak gerçek zamanlı olarak takip edilebilir bölme. Son yıllarda, çok renkli tekniklerde teknik gelişmeler araştırılabilir soru türlerini genişletti. Çok renkli Brainbow yaklaşımı sadece hücreler gibi ayırt etmek için değil, aynı zamanda her bir ata hücresi türetmek ilgili hücrelerin birden fazla farklı klonları renk kodu için kullanılabilir. Bu, geliştirme sırasında birçok farklı klonların ve davranışlarının aynı anda çok katlı bir soy analizine olanak tanır. Burada, gelişmekte olan zebra balığı sinir sistemi içinde çok renkli Brainbow etiketli çok sayıda hücreyi gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için zaman atlamalı konfokal mikroskopiyi kullanma tekniğini açıklıyoruz. Bu, özellikle geleneksel promotör odaklı renkleri kullanarak farklı bir şekilde etiketlemesi zor olan hücreler arasındaki hücresel etkileşimleri takip etmek için yararlıdır. Yaklaşımımız aynı anda birden fazla farklı klon lar arasındaki soy ilişkilerini izlemek için kullanılabilir. Bu teknik kullanılarak oluşturulan büyük veri kümeleri, genetik veya farmakolojik manipülasyonlar arasında nicel olarak karşılaştırılabilen zengin bilgiler sağlar. Sonuçta oluşturulan sonuçlar sinir sisteminin nasıl geliştiği hakkında sistematik sorulara cevap yardımcı olabilir.
Introduction
Gelişimin ilk aşamalarında, özel leştirilmiş progenitor hücrelerinin havuzları proliferatif bölgelerde tekrar tekrar bölünür ve farklı kız hücreleri dizileri üretir. Bu gelişim döneminde doğan hücreler daha sonra farklılaşır ve yeni doğan organları oluşturmak için seyahat ederler. Sinir sisteminde radyal glia gibi atalar ventriküler bölgelerde olgunlaşmamış nöronlara yol açar. Nöronlar ventriküllerden uzaklaşır ve olgunlaşırken, genişleyen doku sonunda beynin son derece karmaşık yapılarını oluşturur1,2,3,4,5,6. Atalarının bölünmesi ve farklılaşma ve nöronların göç arasındaki koordinasyon nihai boyut, şekil belirleyecek ve böylece beynin fonksiyonu, doğrudan davranış etkileyen7,8,9,10. Bu süreçler üzerinde sıkı kontrol açıkça normal beyin gelişimi için çok önemli olmakla birlikte, bu dinamikleri düzenleyen küresel mekanizmalar iyi anlaşılamamıştır. Burada bir hücresel çözünürlükte sinir sistemi gelişimini incelemek için bir araç tarif, araştırmacılar Brainbow ile gelişmekte olan zebrabalığı beyninde progenitor hücreleri ve nöronlar in vivo görselleştirmek ve zaman atlamalı konfokal mikroskopi ile zaman içinde davranışlarını izlemek için izin11. Yaklaşım aynı zamanda gelişmekte olan embriyonun diğer bölümlerini görselleştirmek için adapte edilebilir.
Gelişmekte olan zebra balığı beynindeki hücreleri gözlemlemek ve ayırt etmek için Brainbow hücre etiketlemetekniğini 11’euyarladık. Brainbow, bir hücre popülasyonunu etiketlemek için üç farklı floresan proteinin (FP) rastgele belirlenmiş, birleştirici ekspresyonu kullanır. Brainbow ekspresyonu için varsayılan ifade kırmızı FP dTomato iken, enzim Cre rekombinaz ile rekombinasyon mCerulean (siyan floresan protein, CFP) veya sarı floresan protein (YFP)12,13ifadesi ile sonuçlanır . Bir hücrede ifade edilen her FP’nin birleşik miktarı, hücreye benzersiz bir renk verir ve komşu hücrelerden net görsel ayrım sağlar. Ayrıca, bir ata hücresi bölündüğünde, her kız hücre renk kodlu klonlar üreten ve araştırmacılar hücre soy 11 ,,14izlemek için izin, kendi ana hücreden renk devralacak.11 Başlangıçta farelerde nöronal devreleri analiz etmek için kullanılırken12, Brainbow beri model organizmaların geniş bir yelpazede ifade edilmiştir, zebrabalığı da dahil olmak üzere15.
Tekniğimiz, yaşayan zebra balıklarında zaman içinde birden fazla renk kodlu klonları doğrudan görüntülemek için önceki çok renkli etiketleme ve görüntüleme yöntemlerine dayanmaktadır. Embriyo lar gibi optik şeffaflık nedeniyle, zebra balıkları görüntüleme deneyleri için uygundur16, ve önceki çalışmalarda sinir sistemi11, 15,,17,18,19,20,21,22,23,15,25, çeşitli dokuları incelemek için zebrabalığı Brainbow kullandık24 26,27. Canlı organizmanın doğrudan görüntü yeteneği, onların hızlı eski rahim gelişimi ile birlikte, zebra balığı omurgalı gelişimi değerli bir model yapmak. Memeli beyninin aksine, zebra balığı hindbrain tüm proliferatif bölge endojen çevre6bozulmadan görüntüleme için hazırdır. Bu deneylerin in vitro veya sabit doku preparatları yerine canlı organizmada yapılmasını sağlar. Sabit görüntüleme deneylerinin aksine, in vivo çalışmalar uzunlamasına bir tasarıma olanak sağlayarak desenler için analiz edilebilen saatler süren veriler üreterek nispeten nadir olayları gözlemleme olasılığını artırır. İlgi çekici olayların hızına ve uzunluğuna bağlı olarak, araştırmacılar kısa (1-2 saat) veya uzun (~16 saate kadar) hızlandırılmış görüntüleme deneyleri yapmayı seçebilirler. Zebrabalığı ısı şok organizatörü 70 (hsp70, hsp) kullanılarak, Brainbow ekspresyonu zamansal olarak kontrol edilebilir28,29. Ayrıca, bu organizatör tarafından indüklenen mozaik ifade de etiketleme ve birçok klonlar11izleme için uygundur.
Canlı beyindeki birden fazla klonu görsel olarak tanımlayabilme yeteneği bu yöntemin bir avantajıdır. Sinir sisteminin gelişiminde klonların rolünü araştıran önemli önceki çalışmalar, tek bir ata hücresi ve onun atasını tek bir FP veya diğer kolayca görselleştirilmiş protein kullanarak etiketlemek için retroviral vektörler kullanılmıştır. Bu tür etiketleme araştırmacılar zaman içinde tek bir klon gözlemlemek için izin verir, in vitro veya in vivo2,30,,31,32,33,34,35,36,37,38. Brainbow’un farklı renkleri, bir klondaki hücrelerin davranışını izleme yöntemlerinin aksine, araştırmacıların klonlar arasındaki dinamikleri gözlemlemelerine olanak tanır. Ayrıca, beyindeki birçok klonları etiketlemek için Brainbow kullanılarak, klonal davranışla ilgili ek veriler tek bir klonu11etiketleyen tekniklere göre toplanır. Daha da önemlisi, burada açıklanan yaklaşımlar farklı genetik veya farmakolojik manipülasyonlar18uğramıştır balıklar arasında gelişimsel karşılaştırmalar oluşturmak için genişletilebilir. Genel olarak, bu avantajlar, omurgalı sinir sisteminin gelişimini araştıran araştırmacılar için ideal olan Brainbow ifade eden zebra balığının vivo konfokal görüntülemesinde zaman atlamalı hale getirilmektedir, özellikle de klonların rolüyle ilgilenenler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, gelişmekte olan zebra balığı arka beyninde progenitor hücreleri ve nöronların klonlarını görselleştirmek ve Brainbow ve zaman atlamalı konfokal mikroskopi11kullanarak in vivo onları takip etmek için bir yöntem açıklar. Bu protokolün in vitro veya ex vivo çalışmalara kıyasla en büyük avantajı, omurgalı beyninin proliferatif bölgesini zaman içinde doğal ortamında doğrudan gözlemleyebilme yeteneğidir. Bu teknik retroviral vektörler kullanarak tek bir klo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Y. A. Pan, J. Livet ve Z. Tobias’a teknik ve entelektüel katkıları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı (Ödül 1553764) ve M.J. Murdock Charitable Trust tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1.5mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 134020 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation |
| 50ml conical tubes | Corning | 352070 | For heat shocking embryos |
| 6 lb nylon fishing line | SecureLine | NMT250 | For making embryo manipulators |
| 7.5mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 135010 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | For E3 |
| Cotton swabs | Puritan | 867-WC NO GLUE | For making embryo manipulators |
| Cre recombinase | New England Biolabs | M0298M | |
| Digital dry bath | Genemate | 490016-616 | Used to store LMA at 40°C |
| Epifluorescence dissection scope | |||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Incubator | Forma Scientific | 3158 | To maintain embryos at 28°C |
| Injection plate molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Isotemp water bath | Fisher Scientific | 2320 | For heat shocking embryos |
| KCl | AMRESCO | 0395 | For E3 and for DNA solution for injections |
| Laser-scanning confocal microscope | Zeiss | LSM710 | |
| LE agarose | Genemate | E3120 | To create agarose injection plates |
| Low-melt agarose (LMA) | AMRESCO | J234 | |
| Mating tanks | Aquaneering, Inc. | ZHCT100 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | For E3 |
| MgSO4 | Sigma | 9397 | For E3 |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| MS-222 Tricaine-S | Western Chemical, Inc. | Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | For E3 |
| Petri dishes (90 mm, 60 mm) | Genesee Scientific | 32-107G | To house embryos and create imaging chamber (60 mm) |
| Phenol red | Sigma | P0290 | |
| Soft stitch ring markers | Clover Needlecraft, Inc. | 354 | For creating imaging chamber with Petri dish |
| Super glue (Ultra gel control) | Loctite | 1363589 | For making embryo manipulators |
| Syringe needles | Beckton Dickinson | BD329412 | For dechorionating embryos |
References
- Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
- Mcconnell, S. K. Constructing the Cerebral Cortex: Neurogenesis and Fate Determination Review. Neuron. 15, 761-768 (1995).
- Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish – from embryo to adult. Neural Development. 8, 3 (2013).
- Chenn, A., Walsh, C. Regulation of Cerebral Cortical Size by Control of Cell Cycle Exit in Neural Precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and Evolution of the Human Neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32, 1817-1828 (2013).
- Homem, C. C. F., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nature Reviews Neuroscience. 16 (11), 647-659 (2015).
- Brockway, N. L., et al. Multicolor lineage tracing using in vivo time-lapse imaging reveals coordinated death of clonally related cells in the developing vertebrate brain. Developmental Biology. 453 (2), 130-140 (2019).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
- Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Ko, S. K., Chen, X., Yoon, J., Shin, I. Zebrafish as a good vertebrate model for molecular imaging using fluorescent probes. Chemical Society Reviews. 40, 2120 (2011).
- Kesavan, G., Hammer, J., Hans, S., Brand, M. Targeted knock-in of CreERT2 in zebrafish using CRISPR/Cas9. Cell and Tissue Research. 372, 41-50 (2018).
- Cook, Z. T., et al. Combining near-infrared fluorescence with Brainbow to visualize expression of specific genes within a multicolor context. Molecular Biology of the Cell. 30 (4), 491-505 (2019).
- Kuwata, M., Nikaido, M., Hatta, K. Local heat-shock mediated multi-color labeling visualizing behaviors of enteric neural crest cells associated with division and neurogenesis in zebrafish gut. Developmental Dynamics. 248, 437-448 (2019).
- Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (3), 1164-1169 (2011).
- Heap, L. A., Goh, C. C., Kassahn, K. S., Scott, E. K. Cerebellar Output in Zebrafish: An Analysis of Spatial Patterns and Topography in Eurydendroid Cell Projections. Frontiers in Neural Circuits. 7, 53 (2013).
- Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise Lamination of Retinal Axons Generates Multiple Parallel Input Pathways in the Tectum. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
- Dirian, L., et al. Spatial Regionalization and Heterochrony in the Formation of Adult Pallial Neural Stem Cells. Developmental Cell. 30, 123-136 (2014).
- Chen, X. A., et al. Behavioral/Cognitive QRFP and Its Receptors Regulate Locomotor Activity and Sleep in Zebrafish. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1823-1840 (2016).
- Albadri, S., De Santis, F., Di Donato, V., Del Bene, F., Jaenisch, R., Zhang, F., Gage, F. CRISPR/Cas9-Mediated Knockin and Knockout in Zebrafish. Genome Editing in Neurosciences. , 41-49 (2017).
- Furlan, G., et al. Life-Long Neurogenic Activity of Individual Neural Stem Cells and Continuous Growth Establish an Outside-In Architecture in the Teleost Pallium. Current Biology. 27, 3288-3301 (2017).
- Herget, U., Arturo Gutierrez-Triana, J., Salazar Thula, O., Knerr, B., Ryu, S. Single-cell reconstruction of oxytocinergic neurons reveals separate hypophysiotropic and encephalotropic subtypes in larval zebrafish Brainbow-guided morphology of oxytocinergic cells. eNeuro. 4 (1), (2017).
- Halloran, M. C., et al. Laser-targeted gene expression. Development. 127, 1953-1960 (2000).
- Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50, 401-406 (2008).
- Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a Recombinant Retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
- Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104, 473-482 (1988).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-441 (1992).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Clonal dispersion in proliferative layers of developing cerebral cortex. Nature. 362 (6421), 632-635 (1993).
- Cai, L., Hayes, N. L., Nowakowski, R. S. Synchrony of Clonal Cell Proliferation and Contiguity of Clonally Related Cells: Production of Mosaicism in the Ventricular Zone of Developing Mouse Neocortex. The Journal of Neuroscience. 17 (6), 2088-2100 (1997).
- Reznikov, K., Acklin, S. E., Van Der Kooy, D. Clonal Heterogeneity in the Early Embryonic Rodent Cortical Germinal Zone and the Separation of Subventricular From Ventricular Zone Lineages. Developmental Dynamics. 210, 328-343 (1997).
- Qian, X., Goderie, S., Shen, Q., Stern, J., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125, 3143-3152 (1998).
- McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic Neural Progenitors Appear to Be Restricted to Regional and Glial Fates before the Onset of Neurogenesis. The Journal of Neuroscience. 21 (17), 6772-6781 (2001).
- Yu, Y. C., Bultje, R. S., Wang, X., Shi, S. H. Specific synapses develop preferentially among sister excitatory neurons in the neocortex. Nature. 458 (7237), 501-504 (2009).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish Breeding in the Laboratory Environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. 25, e1115 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- R Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2017).
- Smith, M. R. . Ternary: an R package to generate ternary plots. , (2017).
- Baye, L. M., Link, B. A. Development/Plasticity/Repair Interkinetic Nuclear Migration and the Selection of Neurogenic Cell Divisions during Vertebrate Retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
- Leung, L., Klopper, A. V., Grill, S. W., Harris, W. A., Norden, C. Apical migration of nuclei during G2 is a prerequisite for all nuclear motion in zebrafish neuroepithelia. Development. 139, 2635 (2012).
- Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H., Curriet, A. R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wide-ranging Implications in Tissue Kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239 (1972).
- Cole, L. K., Ross, L. S. Apoptosis in the Developing Zebrafish Embryo. Developmental Biology. 240, 123-142 (2001).
- Liao, J., He, J., Yan, T., Korzh, V., Gong, Z. A Class of NeuroD-Related Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Expressed in Developing Central Nervous System in Zebrafish. DNA and Cell Biology. 18 (4), 333-344 (1999).
- Trevarrow, B., Marks, D. L., Kimmel, C. B. Organization of hindbrain segments in the zebrafish embryo. Neuron. 4 (5), 669-679 (1990).
- Yabu, T., Todoriki, S., Yamashita, M. Stress-induced apoptosis by heat shock, UV and gamma-ray irradiation in zebrafish embryos detected by increased caspase activity and whole-mount TUNEL staining. Fisheries Science. 67, 333-340 (2001).
