Brainbowとタイムラプス共焦点イメージングを用いた生きているゼブラフィッシュの発達脳の可視化
Summary
インビボイメージングは、神経系の発達の根底にある細胞メカニズムを調査するために使用できる強力なツールです。ここでは、開発中のゼブラフィッシュ神経系の中で、多色Brainbow標識細胞をリアルタイムに可視化するために、タイムラプス共焦点顕微鏡を用いる手法について説明する。
Abstract
脊椎動物神経系の発達には、複雑な細胞行動と相互作用の正確な調整が必要です。高分解能in vivoイメージング技術を用いることは、生物におけるこれらのプロセスに明確な窓を提供することができる。例えば、細胞とその子孫の分裂は、神経系が形成するにつれてリアルタイムで追跡することができる。近年、多色技術の技術の進歩は、調査できる質問の種類を拡大しています。多色Brainbowアプローチは、細胞の間で区別するだけでなく、それぞれが1つの前駆細胞から派生する関連する細胞の複数の異なるクローンを色分けするためにも使用できます。これにより、開発中に多くの異なるクローンとその動作を同時に多重系統解析できます。ここでは、開発中のゼブラフィッシュ神経系の中で、多色Brainbow標識細胞をリアルタイムで可視化するために、タイムラプス共焦点顕微鏡を使用する技術について説明します。これは、従来のプロモーター駆動色を使用して差し分化ラベルを付け難い細胞間の細胞相互作用に従う場合に特に有用である。このアプローチは、複数の異なるクローン間の系統関係を同時に追跡するために使用できます。この手法を使用して生成される大規模なデータセットは、遺伝的または薬理学的操作全体で定量的に比較できる豊富な情報を提供します。最終的に生成された結果は、神経系がどのように発達するかについての体系的な質問に答えるのに役立ちます。
Introduction
開発の初期段階では、特殊な前駆細胞のプールが増殖ゾーンで繰り返し分裂し、多様な娘細胞を産生する。この発達期に生まれた細胞は、分化し、新生器官を形成するために移動します。神経系では、放射状グリアなどの前駆物質は、心室領域の未熟なニューロンを生じさせる。ニューロンが心室から離れて成熟するにつれて、膨張する組織は最終的に脳11、2、3、4、5、62,3,4,5の非常に複雑な構造を6形成する。ニューロンの前駆体の分裂と分化と移動との間の調整は、脳の最終的な大きさ、形状、したがって機能を決定し、行動77、8、9、108,9,10に直接影響を与える。これらのプロセスを厳しく制御することは、正常な脳の発達にとって明らかに重要ですが、これらのダイナミクスを調節するグローバルメカニズムはよく理解されていません。ここでは、細胞分解能で神経系の発達を研究するツールを説明し、研究者はBrainbowで発達中のゼブラフィッシュ脳の生体内の前駆細胞およびニューロンを視覚化し、時間経過共焦点顕微鏡11を介して時間をかけてその行動を追跡することを可能にする。このアプローチは、発達中の胚の他の部分を視覚化するためにも適応することができる。
開発中のゼブラフィッシュ脳の細胞間を観察し、区別するために、我々はBrainbow細胞標識技術11を適応させました。Brainbowは、3つの異なる蛍光タンパク質(FP)の無作為に決定された組み合わせ発現を利用して、細胞の集団にラベルを付けます。Brainbow発現のデフォルトの発現は赤FPdTomatoであるが、酵素Creリコンビナーゼによる再結合は、mCerulean(シアン蛍光タンパク質、CFP)または黄色蛍光タンパク質(YFP)12,13,13の発現をもたらす。細胞内で表現される各FPの結合量は、それに固有の色合いを与え、隣接する細胞から明確な視覚的な区別を可能にする。さらに、前駆細胞が分裂すると、各娘細胞は母細胞から色を継承し、色分けされたクローンを産生し、研究者が細胞系11,14,14を追跡することを可能にする。もともとマウス12の神経回路を解析するために使用されるが、Brainbowは、ゼブラフィッシュ15を含む多種多様なモデル生物で発現されている。
私たちの技術は、生きているゼブラフィッシュで時間の経過とともに複数の色分けされたクローンを直接画像化するための以前の多色ラベリングとイメージング方法に基づいています。胚としての光学的透明性のために、ゼブラフィッシュはイメージング実験,16に適しており、以前の研究では、ゼブラフィッシュのBrainbowを利用して、,神経系11、15、17、18、19、20、21、22、23、24、25を含む様々な組織18,19,20,2111,15,1723を24,25研究してきました22,。2626、27。,生物を直接画像化する能力は、彼らの急速な元子宮の開発と共に、ゼブラフィッシュを脊椎動物の発達の貴重なモデルにします。哺乳動物の脳とは対照的に、ゼブラフィッシュ後脳の増殖帯全体が、その内因性環境6に中断することなく画像化のために容易に利用できる。これにより、インビトロや固定組織製剤ではなく、生体内で実験を行うことができます。固定画像実験とは対照的に、in vivoの研究では縦方向の設計が可能になり、パターンについて分析できる時間のデータが生成され、比較的まれな事象を観察する可能性が高くなります。関心のある事象の速度と長さに応じて、研究者は短い(1-2時間)または長い(〜16時間まで)のタイムラプスイメージング実験を行うことを選択できます。ゼブラフィッシュヒートショックプロモーター70(hsp70,hsp)を用いることで、Brainbow発現を28,29,29に時間的に制御することができる。さらに、このプロモーターによって誘導されるモザイク表現は、多くのクローン11の標識および追跡に適している。
生きている脳内の複数のクローンを視覚的に識別する能力は、この方法の利点です。神経系の発達中のクローンの役割を調査した重要な以前の研究は、単一のFPまたは他の容易に視覚化されたタンパク質を使用して、単一の前駆細胞とその子孫を標識するためにレトロウイルスベクターを利用した。このようなラベリングは、インビトロまたはin vivo,,,,,,22、30、31、32、33、34、35、36、37、3830,31のいずれかで、時間をかけて単一のクローン3337を38観察することができます。323435361つのクローン内の細胞の挙動を追跡する方法とは対照的に、Brainbowの異なる色は、研究者がクローン間のダイナミクスを観察することを可能にする。さらに、Brainbowを使用して脳内の多くのクローンにラベルを付け、クローンの挙動に関する追加データが、単一クローン11にラベルを付ける技術に関連して収集される。重要なことに、ここで説明するアプローチは、異なる遺伝的または薬理学的操作を受けた魚間の発達的比較を生成するために拡大することができる18。全体的に見て、これらの利点は、脊椎動物神経系の発達を探求する研究者、特にクローンの役割に興味を持つ研究者にとって理想的なBrainbow発現ゼブラフィッシュのインビボ共焦点イメージングのタイムラプスを作る。
Protocol
Representative Results
Discussion
本プロトコルは、開発中のゼブラフィッシュ後脳における前駆細胞およびニューロンのクローンを可視化し、Brainbowおよびタイムラプス共焦点顕微鏡11を用いて生体内でそれらに従う方法を説明する。インビトロまたはエキビボ研究と比較してこのプロトコルの主な利点は、時間の経過とともに脊椎動物の脳の増殖帯を直接観察する能力である。この技術は、レトロウイルス…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
技術的および知的な貢献に対して、Y.A.パン、J.リベット、Z.トビアスに感謝します。この作品は、国立科学財団(賞1553764)とM.J.マードック慈善信託によって支援されました。
Materials
| 1.5mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 134020 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation |
| 50ml conical tubes | Corning | 352070 | For heat shocking embryos |
| 6 lb nylon fishing line | SecureLine | NMT250 | For making embryo manipulators |
| 7.5mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 135010 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | For E3 |
| Cotton swabs | Puritan | 867-WC NO GLUE | For making embryo manipulators |
| Cre recombinase | New England Biolabs | M0298M | |
| Digital dry bath | Genemate | 490016-616 | Used to store LMA at 40°C |
| Epifluorescence dissection scope | |||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Incubator | Forma Scientific | 3158 | To maintain embryos at 28°C |
| Injection plate molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Isotemp water bath | Fisher Scientific | 2320 | For heat shocking embryos |
| KCl | AMRESCO | 0395 | For E3 and for DNA solution for injections |
| Laser-scanning confocal microscope | Zeiss | LSM710 | |
| LE agarose | Genemate | E3120 | To create agarose injection plates |
| Low-melt agarose (LMA) | AMRESCO | J234 | |
| Mating tanks | Aquaneering, Inc. | ZHCT100 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | For E3 |
| MgSO4 | Sigma | 9397 | For E3 |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| MS-222 Tricaine-S | Western Chemical, Inc. | Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | For E3 |
| Petri dishes (90 mm, 60 mm) | Genesee Scientific | 32-107G | To house embryos and create imaging chamber (60 mm) |
| Phenol red | Sigma | P0290 | |
| Soft stitch ring markers | Clover Needlecraft, Inc. | 354 | For creating imaging chamber with Petri dish |
| Super glue (Ultra gel control) | Loctite | 1363589 | For making embryo manipulators |
| Syringe needles | Beckton Dickinson | BD329412 | For dechorionating embryos |
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