무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화
Summary
생체 내 이미징은 신경계 발달의 근본적인 세포 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기에서 우리는 개발 제브라피시 신경계 내의 다중 색깔 Brainbow 표지세포의 다수를 구상하기 위하여 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 이용하기 위한 기술을 기술합니다.
Abstract
척추 동물 신경계의 발달은 복잡한 세포 행동 및 상호 작용의 정확한 조정을 요구합니다. 생체 내 이미징 기술에서 고해상도의 사용은 살아있는 유기체에서 이러한 과정에 명확한 창을 제공 할 수 있습니다. 예를 들면, 세포와 그들의 자손을 나누는 것은 신경계가 형성될 때 실시간으로 따를 수 있습니다. 최근 몇 년 동안, 다색 기술의 기술 발전은 조사 할 수있는 질문의 유형을 확장했다. 다중 색 Brainbow 접근법은 세포와 같은 것을 구별할 뿐만 아니라, 각각 하나의 전구 세포로부터 파생되는 관련 세포의 여러 가지 다른 클론을 색상 코드화하는 데 사용될 수 있습니다. 이를 통해 개발 중에 다양한 클론과 해당 동작의 멀티플렉스 계보 분석을 동시에 수행할 수 있습니다. 여기에서 우리는 개발 제브라피시 신경계 내의 다중 색깔 Brainbow 표지세포의 다수를 구상하기 위하여 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 이용하기 위한 기술을 기술합니다. 이것은 전통적인 프로모터 구동 색상을 사용하여 차별화하기 어려운 세포 들 간의 세포 상호 작용을 따르는 데 특히 유용합니다. 우리의 접근 방식은 동시에 여러 다른 클론 간의 계보 관계를 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 생성된 대규모 데이터 세트는 유전적 또는 약리학적 조작에 걸쳐 정량적으로 비교할 수 있는 풍부한 정보를 제공합니다. 궁극적으로 생성 된 결과 신 경계 개발 방법에 대 한 체계적인 질문에 대답 하는 데 도움이 수 있습니다.
Introduction
발달의 초기 단계에서, 전문화한 선조 세포의 풀은 증식 지역에서 반복적으로 분할하여 딸 세포의 다양한 배열을 생성합니다. 이 발달 기간 도중 품어든 세포는 그 때 분화하고 초기 기관을 형성하기 위하여 여행할 것입니다. 신경계에서는 방사형 glia와 같은 선조가 심실 영역에서 미성숙한 뉴런을 발생시다. 뉴런이 심실에서 멀어지고 성숙함에 따라 확장 조직은 결국 뇌의 매우 복잡한 구조를 형성합니다11,2,3,34,45,,56. 선조의 분열과 뉴런의 분화 및 이동 사이의 조정은 뇌의 최종 크기, 모양 및 따라서 기능을 결정하며, 행동7,,8,,9,,10에직접적인 영향을 미칩니다. 이러한 프로세스에 대 한 엄격한 제어는 명확 하 게 정상적인 두뇌 개발에 대 한 중요 한 동안, 이러한 역학을 조절 하는 글로벌 메커니즘은 잘 이해 되지 않습니다. 여기에서 우리는 세포 해결책에 있는 신경계 발달을 공부하는 공구를 기술합니다, 연구원이 Brainbow를 가진 개발 제브라피시 두뇌에 있는 생체 내 선조 세포 및 신경세포를 구상하고 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 통해 그들의 행동을 추적하는 것을허용합니다 11. 접근은 또한 발전 태아의 그밖 부분을 구상하기 위하여 적응될 수 있습니다.
제브라피쉬 뇌의 세포를 관찰하고 구별하기 위해, 우리는 Brainbow 세포 라벨링 기술11을적용했습니다. Brainbow는 세포의 인구를 표시하기 위하여 3개의 명백한 형광성 단백질 (FPs)의 무작위로 결정된, 조합식 식을 이용합니다. Brainbow 발현에 대한 기본 발현은 적색 FP dTomato인 반면, 효소 Cre 재조합효소에 의한 재조합은 mCerulean(청색 형광 단백질, CFP) 또는 황색 형광 단백질(YFP)12,,13의발현을 초래한다. 세포에서 발현되는 각 FP의 결합된 양은 독특한 색조를 제공하여 인접한 세포와 명확한 시각적 구별을 허용합니다. 추가적으로, 선조 세포가 분할할 때, 각 딸 세포는 그것의 어머니 세포에서 색깔을 승계할 것입니다, 색깔 로 구분된 클론을 생성하고 연구원이 세포 계보를 추적하는 것을허용합니다 11,,14. 원래 마우스12에서뉴런 회로를 분석하는 데 사용되었지만, Brainbow는 이후 제브라피시15를포함한 다양한 모델 유기체로 표현되어 왔다.
우리의 기술은 살아있는 제브라피시에서 시간이 지남에 따라 여러 가지 색상 으로 구분 된 클론을 직접 이미지화하기 위해 이전의 다색 라벨링 및 이미징 방법을 기반으로합니다. 배아로서의 광학적 투명성으로 인해 제브라피쉬는 이미징 실험,16에적합하며, 이전 연구에서는 제브라피쉬의 Brainbow를 활용하여 신경계11, 15,,15,17,,18,19,,20,,21,22,,,23,,24,,25,, 26,27. 살아있는 유기체로 직접 이미지화 할 수있는 능력과 빠른 자궁 발달로 얼룩말은 척추 동물 발달의 귀중한 모델로 만듭니다. 포유류 뇌와 는 달리, 제브라피쉬 뒷뇌의 전체 증식 영역은 내인성 환경에 지장을 주지 않고 이미징을 위해 쉽게 사용할 수 있다6. 이것은 시험관 내 또는 고정된 조직 준비보다는 살아있는 유기체에서 실험이 실행될 수 있습니다. 고정 된 이미징 실험과는 달리 생체 내 연구는 세로 설계를 허용하여 패턴을 분석 할 수있는 몇 시간의 데이터를 생성하므로 상대적으로 드문 사건을 관찰 할 가능성이 높아집니다. 관심 있는 사건의 속도와 길이에 따라, 연구원은 짧은 (1-2 시간) 또는 긴 (~16 시간) 시간 경과 화상 진찰 실험을 능력을 발휘하도록 선택할 수 있습니다. 제브라피쉬 열충격프로모터(70)(hsp70, hsp)를 이용하여, 무지개발현은28,,29를시간적으로 조절할 수 있다. 부가적으로, 이러한 프로모터에 의해 유도된 모자이크 발현은 많은클론(11)에라벨링 및 추적에 적합하다.
살아있는 두뇌 내의 다중 클론을 시각적으로 확인하는 기능은 이 방법의 이점입니다. 신경계의 발달 내에서 클론의 역할을 조사한 중요한 이전 연구는 단일 전구 세포및 그 자손에게 단일 FP 또는 기타 쉽게 시각화된 단백질을 사용하여 라벨을 붙이기 위해 레트로바이러스 벡터를 활용하였다. 이러한 라벨링은 연구원이 생체 외 또는 생체 내2,,30, 31,,3231,,33,34,35,36,37,,38에서시간이 지남에 따라 단일 복제를 관찰 할 수 있게합니다. 하나의 클론 내에서 세포의 동작을 추적하는 방법과는 달리, Brainbow의 뚜렷한 색상은 연구원이 클론 중 역학을 관찰 할 수 있습니다. 추가적으로, 뇌 내의 많은 클론에 레이블을 Brainbow를 사용하여, 복제 동작에 대한 추가 데이터는 단일 클론11에레이블을 지정하는 기술에 비해 수집된다. 중요한 것은, 여기에 기술된 접근법은 상이한 유전적 또는 약리학적 조작을 겪은 물고기 들 사이의 발달 비교를 생성하기 위해 확장될 수 있다18. 전반적으로, 이러한 장점은 척추 동물 신경계의 개발을 탐구하는 연구자, 특히 클론의 역할에 관심이있는 연구자들에게 이상적인 Brainbow 표현 얼룩말의 생체 내 공초점 이미징에서 시간 경과를 만듭니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 발달하는 제브라피쉬 뒷뇌에서 전구 세포 및 뉴런의 클론을 시각화하고 이를 뇌무지개 및 타임랩스 공초점 현미경 검사법11을사용하여 생체 내에서 따르는 방법을 설명한다. 생체외 또는 생체외 연구에 비해 이 프로토콜의 주요 장점은 시간이 지남에 따라 자연 적인 milieu에서 척추 동물 뇌의 증식 영역을 직접 관찰 하는 기능. 이 기술은 retroviral 벡터를 사용하여 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Y. A. Pan, J. Livet 및 Z. Tobias에게 기술적, 지적 공헌에 감사드립니다. 이 작품은 국립 과학 재단 (상 1553764)와 M.J. 머독 자선 신탁에 의해 지원되었다.
Materials
| 1.5mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 134020 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation |
| 50ml conical tubes | Corning | 352070 | For heat shocking embryos |
| 6 lb nylon fishing line | SecureLine | NMT250 | For making embryo manipulators |
| 7.5mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 135010 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | For E3 |
| Cotton swabs | Puritan | 867-WC NO GLUE | For making embryo manipulators |
| Cre recombinase | New England Biolabs | M0298M | |
| Digital dry bath | Genemate | 490016-616 | Used to store LMA at 40°C |
| Epifluorescence dissection scope | |||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Incubator | Forma Scientific | 3158 | To maintain embryos at 28°C |
| Injection plate molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Isotemp water bath | Fisher Scientific | 2320 | For heat shocking embryos |
| KCl | AMRESCO | 0395 | For E3 and for DNA solution for injections |
| Laser-scanning confocal microscope | Zeiss | LSM710 | |
| LE agarose | Genemate | E3120 | To create agarose injection plates |
| Low-melt agarose (LMA) | AMRESCO | J234 | |
| Mating tanks | Aquaneering, Inc. | ZHCT100 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | For E3 |
| MgSO4 | Sigma | 9397 | For E3 |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| MS-222 Tricaine-S | Western Chemical, Inc. | Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | For E3 |
| Petri dishes (90 mm, 60 mm) | Genesee Scientific | 32-107G | To house embryos and create imaging chamber (60 mm) |
| Phenol red | Sigma | P0290 | |
| Soft stitch ring markers | Clover Needlecraft, Inc. | 354 | For creating imaging chamber with Petri dish |
| Super glue (Ultra gel control) | Loctite | 1363589 | For making embryo manipulators |
| Syringe needles | Beckton Dickinson | BD329412 | For dechorionating embryos |
References
- Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
- Mcconnell, S. K. Constructing the Cerebral Cortex: Neurogenesis and Fate Determination Review. Neuron. 15, 761-768 (1995).
- Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish – from embryo to adult. Neural Development. 8, 3 (2013).
- Chenn, A., Walsh, C. Regulation of Cerebral Cortical Size by Control of Cell Cycle Exit in Neural Precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and Evolution of the Human Neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32, 1817-1828 (2013).
- Homem, C. C. F., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nature Reviews Neuroscience. 16 (11), 647-659 (2015).
- Brockway, N. L., et al. Multicolor lineage tracing using in vivo time-lapse imaging reveals coordinated death of clonally related cells in the developing vertebrate brain. Developmental Biology. 453 (2), 130-140 (2019).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
- Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Ko, S. K., Chen, X., Yoon, J., Shin, I. Zebrafish as a good vertebrate model for molecular imaging using fluorescent probes. Chemical Society Reviews. 40, 2120 (2011).
- Kesavan, G., Hammer, J., Hans, S., Brand, M. Targeted knock-in of CreERT2 in zebrafish using CRISPR/Cas9. Cell and Tissue Research. 372, 41-50 (2018).
- Cook, Z. T., et al. Combining near-infrared fluorescence with Brainbow to visualize expression of specific genes within a multicolor context. Molecular Biology of the Cell. 30 (4), 491-505 (2019).
- Kuwata, M., Nikaido, M., Hatta, K. Local heat-shock mediated multi-color labeling visualizing behaviors of enteric neural crest cells associated with division and neurogenesis in zebrafish gut. Developmental Dynamics. 248, 437-448 (2019).
- Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (3), 1164-1169 (2011).
- Heap, L. A., Goh, C. C., Kassahn, K. S., Scott, E. K. Cerebellar Output in Zebrafish: An Analysis of Spatial Patterns and Topography in Eurydendroid Cell Projections. Frontiers in Neural Circuits. 7, 53 (2013).
- Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise Lamination of Retinal Axons Generates Multiple Parallel Input Pathways in the Tectum. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
- Dirian, L., et al. Spatial Regionalization and Heterochrony in the Formation of Adult Pallial Neural Stem Cells. Developmental Cell. 30, 123-136 (2014).
- Chen, X. A., et al. Behavioral/Cognitive QRFP and Its Receptors Regulate Locomotor Activity and Sleep in Zebrafish. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1823-1840 (2016).
- Albadri, S., De Santis, F., Di Donato, V., Del Bene, F., Jaenisch, R., Zhang, F., Gage, F. CRISPR/Cas9-Mediated Knockin and Knockout in Zebrafish. Genome Editing in Neurosciences. , 41-49 (2017).
- Furlan, G., et al. Life-Long Neurogenic Activity of Individual Neural Stem Cells and Continuous Growth Establish an Outside-In Architecture in the Teleost Pallium. Current Biology. 27, 3288-3301 (2017).
- Herget, U., Arturo Gutierrez-Triana, J., Salazar Thula, O., Knerr, B., Ryu, S. Single-cell reconstruction of oxytocinergic neurons reveals separate hypophysiotropic and encephalotropic subtypes in larval zebrafish Brainbow-guided morphology of oxytocinergic cells. eNeuro. 4 (1), (2017).
- Halloran, M. C., et al. Laser-targeted gene expression. Development. 127, 1953-1960 (2000).
- Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50, 401-406 (2008).
- Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a Recombinant Retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
- Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104, 473-482 (1988).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-441 (1992).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Clonal dispersion in proliferative layers of developing cerebral cortex. Nature. 362 (6421), 632-635 (1993).
- Cai, L., Hayes, N. L., Nowakowski, R. S. Synchrony of Clonal Cell Proliferation and Contiguity of Clonally Related Cells: Production of Mosaicism in the Ventricular Zone of Developing Mouse Neocortex. The Journal of Neuroscience. 17 (6), 2088-2100 (1997).
- Reznikov, K., Acklin, S. E., Van Der Kooy, D. Clonal Heterogeneity in the Early Embryonic Rodent Cortical Germinal Zone and the Separation of Subventricular From Ventricular Zone Lineages. Developmental Dynamics. 210, 328-343 (1997).
- Qian, X., Goderie, S., Shen, Q., Stern, J., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125, 3143-3152 (1998).
- McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic Neural Progenitors Appear to Be Restricted to Regional and Glial Fates before the Onset of Neurogenesis. The Journal of Neuroscience. 21 (17), 6772-6781 (2001).
- Yu, Y. C., Bultje, R. S., Wang, X., Shi, S. H. Specific synapses develop preferentially among sister excitatory neurons in the neocortex. Nature. 458 (7237), 501-504 (2009).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish Breeding in the Laboratory Environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. 25, e1115 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- R Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2017).
- Smith, M. R. . Ternary: an R package to generate ternary plots. , (2017).
- Baye, L. M., Link, B. A. Development/Plasticity/Repair Interkinetic Nuclear Migration and the Selection of Neurogenic Cell Divisions during Vertebrate Retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
- Leung, L., Klopper, A. V., Grill, S. W., Harris, W. A., Norden, C. Apical migration of nuclei during G2 is a prerequisite for all nuclear motion in zebrafish neuroepithelia. Development. 139, 2635 (2012).
- Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H., Curriet, A. R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wide-ranging Implications in Tissue Kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239 (1972).
- Cole, L. K., Ross, L. S. Apoptosis in the Developing Zebrafish Embryo. Developmental Biology. 240, 123-142 (2001).
- Liao, J., He, J., Yan, T., Korzh, V., Gong, Z. A Class of NeuroD-Related Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Expressed in Developing Central Nervous System in Zebrafish. DNA and Cell Biology. 18 (4), 333-344 (1999).
- Trevarrow, B., Marks, D. L., Kimmel, C. B. Organization of hindbrain segments in the zebrafish embryo. Neuron. 4 (5), 669-679 (1990).
- Yabu, T., Todoriki, S., Yamashita, M. Stress-induced apoptosis by heat shock, UV and gamma-ray irradiation in zebrafish embryos detected by increased caspase activity and whole-mount TUNEL staining. Fisheries Science. 67, 333-340 (2001).
