ब्रूरेन और टाइम-लैप्स कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग करके ज़ेब्राफिश में विकासशील मस्तिष्क की कल्पना करना
Summary
वीवो इमेजिंग में एक शक्तिशाली उपकरण है जिसका उपयोग तंत्रिका तंत्र के विकास में अंतर्निहित सेलुलर तंत्र की जांच करने के लिए किया जा सकता है। यहां हम विकासशील जेब्राफिश तंत्रिका तंत्र के भीतर वास्तविक समय में बड़ी संख्या में मल्टीकलर ब्रून-लेबल कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए एक तकनीक का वर्णन करते हैं।
Abstract
कशेरुकी तंत्रिका तंत्र के विकास के लिए जटिल सेलुलर व्यवहार और बातचीत के सटीक समन्वय की आवश्यकता होती है। वीवो इमेजिंग तकनीकों में उच्च संकल्प का उपयोग जीवित जीव में इन प्रक्रियाओं में एक स्पष्ट खिड़की प्रदान कर सकता है। उदाहरण के लिए, कोशिकाओं और उनकी संतानों को विभाजित करने का पालन वास्तविक समय में किया जा सकता है क्योंकि तंत्रिका तंत्र रूपों। हाल के वर्षों में, बहुरंगी तकनीकों में तकनीकी प्रगति ने उन प्रश्नों के प्रकारों का विस्तार किया है जिनकी जांच की जा सकती है। बहुरंगी ब्रून दृष्टिकोण का उपयोग न केवल कोशिकाओं की तरह भेद करने के लिए किया जा सकता है, बल्कि संबंधित कोशिकाओं के कई अलग-अलग क्लोन रंग-कोड के लिए भी किया जा सकता है जो प्रत्येक एक जनक कोशिका से प्राप्त होते हैं। यह विकास के दौरान एक साथ कई अलग-अलग क्लोन और उनके व्यवहार के मल्टीप्लेक्स वंश विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। यहां हम विकासशील जेब्राफिश तंत्रिका तंत्र के भीतर वास्तविक समय में बड़ी संख्या में बहुरंगी ब्रून-लेबल कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए एक तकनीक का वर्णन करते हैं। यह कोशिकाओं की तरह के बीच सेलुलर बातचीत का पालन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, जो पारंपरिक प्रमोटर संचालित रंगों का उपयोग करके अलग-अलग लेबल करना मुश्किल है। हमारे दृष्टिकोण का उपयोग एक साथ कई अलग-अलग क्लोन के बीच वंश संबंधों को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग करके उत्पन्न बड़े डेटासेट समृद्ध जानकारी प्रदान करते हैं जिनकी तुलना आनुवंशिक या औषधीय जोड़तोड़ में मात्रात्मक रूप से की जा सकती है। अंततः उत्पन्न परिणाम तंत्रिका तंत्र कैसे विकसित होते हैं, इसबारे में व्यवस्थित सवालों का जवाब देने में मदद कर सकते हैं।
Introduction
विकास के प्रारंभिक चरणों में, विशेष जनक कोशिकाओं के पूल बार-बार प्रजनक क्षेत्रों में विभाजित होते हैं, जिससे बेटी कोशिकाओं की विविध सरणी का उत्पादन होता है। इस विकास अवधि के दौरान पैदा हुई कोशिकाएं तब अंतर करेंगी और नवजात अंगों के रूप में यात्रा करेंगी। तंत्रिका तंत्र में, रेडियल ग्लिया जैसे जनक वेंट्रिकुलर क्षेत्रों में अपरिपक्व न्यूरॉन्स को जन्म देते हैं। जैसे ही न्यूरॉन्स वेंट्रिकल्स और परिपक्व से दूर चले जाते हैं, विस्तार ऊतक अंततः मस्तिष्क की अत्यधिक जटिल संरचनाएं1,,2,,3,,4,,5,,6बनाता है। जनकों के विभाजन और न्यूरॉन्स के भेदभाव और प्रवास के बीच समन्वय अंतिम आकार, आकार, और इस प्रकार मस्तिष्क के कार्य को निर्धारित करेगा, जो सीधे व्यवहार7,8,8,9,,10को प्रभावित करता है। जबकि इन प्रक्रियाओं पर तंग नियंत्रण सामान्य मस्तिष्क के विकास के लिए स्पष्ट रूप से महत्वपूर्ण है, इन गतिशीलता को विनियमित करने वाले वैश्विक तंत्र को अच्छी तरह से समझ में नहीं आता है। यहां हम एक सेलुलर संकल्प पर तंत्रिका तंत्र के विकास का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण का वर्णन करते हैं, जिससे शोधकर्ताओं को बोरेन के साथ विकसित जेब्राफिश मस्तिष्क में वीवो में जनक कोशिकाओं और न्यूरॉन्स की कल्पना करने की अनुमति मिल जाती है और समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी11के माध्यम से समय के साथ उनके व्यवहार को ट्रैक किया जा सकता है। दृष्टिकोण को विकासशील भ्रूण के अन्य हिस्सों की कल्पना करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।
विकासशील जेब्राफिश मस्तिष्क में कोशिकाओं के बीच निरीक्षण और भेद करने के लिए, हमने ब्रैनबोसेल-लेबलिंग तकनीक11को अनुकूलित किया है। Brainbow कोशिकाओं की आबादी लेबल करने के लिए तीन अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) की बेतरतीब ढंग से निर्धारित, संयोजन अभिव्यक्ति का उपयोग करता है । जबकि ब्रैनइंद्रधनुष अभिव्यक्ति के लिए डिफ़ॉल्ट अभिव्यक्ति लाल एफपी dTomato है, एंजाइम क्रे द्वारा पुनर्संयोजन के परिणामस्वरूप मैसेरूलन (सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन, सीएफपी) या येलो फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी)12,,13की अभिव्यक्ति होती है। एक सेल में व्यक्त प्रत्येक एफपी की संयुक्त राशि इसे एक अनूठा रंग देती है, जिससे पड़ोसी कोशिकाओं से स्पष्ट दृश्य भेद होता है। इसके अतिरिक्त, जब एक जनक कोशिका विभाजित होती है, तो प्रत्येक बेटी सेल अपनी मदर सेल से रंग का वारिस होगा, रंग-कोडित क्लोन का उत्पादन करेगा और शोधकर्ताओं को सेल वंश11,,14का पता लगाने की अनुमति देगा। जबकि मूल रूप से चूहों12में न्यूरोनल सर्किटरी का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाता है, इसके बाद से ब्रैनरेन को जेब्राफिश15सहित विभिन्न प्रकार के मॉडल जीवों में व्यक्त किया गया है।
हमारी तकनीक पिछले मल्टीकलर लेबलिंग और इमेजिंग तरीकों पर बनाता है सीधे ज़ेब्राफ़िश रहने में समय के साथ कई रंग कोडित क्लोन छवि । भ्रूण के रूप में उनकी ऑप्टिकल पारदर्शिता के कारण, जेब्राफिश इमेजिंग प्रयोगों के लिए अच्छी तरह से अनुकूलहैं,और पिछले अध्ययनों ने तंत्रिका तंत्र11,,15,,17,18,,19,,20, 21,,,21,22,,23,,24,,25सहित विभिन्न ऊतकों का अध्ययन करने के लिए जेब्राफिश में ब्रून का उपयोग कियाहै, 26,27. जीवित जीव में सीधे छवि बनाने की क्षमता, उनके तेजी से पूर्व गर्भाशय विकास के साथ, जेब्राफिश को कशेरुकी विकास का एक मूल्यवान मॉडल बनाती है। स्तनधारी मस्तिष्क के विपरीत, जेब्राफिश हिंदब्रेन का पूरा प्रसारक्षेत्र अपने एंडोजेनस वातावरण6में व्यवधान के बिना इमेजिंग के लिए आसानी से उपलब्ध है। यह इन विट्रो या निश्चित ऊतक तैयारी के बजाय जीवित जीव में प्रयोग ों को आयोजित करने की अनुमति देता है। निश्चित इमेजिंग प्रयोगों के विपरीत, वीवो अध्ययनों में एक देशीयंधात्मक डिजाइन के लिए अनुमति देते हैं, जो पैटर्न के लिए विश्लेषण किए जा सकने वाले घंटों के डेटा का उत्पादन करते हैं, इस प्रकार अपेक्षाकृत दुर्लभ घटनाओं को देखने की संभावना बढ़ जाती है। गति और ब्याज की घटनाओं की लंबाई के आधार पर, शोधकर्ताओं ने कम (1-2 घंटे) या लंबे समय (~16 घंटे तक) समय चूक इमेजिंग प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए चुन सकते हैं । जेब्राफिश हीट शॉक प्रमोटर 70 (एचएसपी70, एचएसपी) का उपयोग करके, ब्रैनइंद्रधनुष अभिव्यक्ति को28,,29को नियंत्रित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, इस प्रमोटर द्वारा प्रेरित मोज़ेक अभिव्यक्ति कई क्लोन11को लेबल करने और ट्रैक करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।
जीवित मस्तिष्क के भीतर कई क्लोन की पहचान करने की क्षमता इस विधि का लाभ है। तंत्रिका तंत्र के विकास के भीतर क्लोन की भूमिका की जांच करने वाले महत्वपूर्ण पिछले अध्ययनों ने एक ही प्रोजेनिटर सेल और इसकी संतान को एक एफपी या अन्य आसानी से कल्पना प्रोटीन का उपयोग करके लेबल करने के लिए रेट्रोवायरल वैक्टर का उपयोग किया। इस तरह की लेबलिंग शोधकर्ताओं को समय के साथ एक ही क्लोन का पालन करने की अनुमति देती है, या तो इन विट्रो में,या वीवो2, 30 ,31,,,32,33,3431,35 ,3636,37,38में ।, एक क्लोन के भीतर कोशिकाओं के व्यवहार को ट्रैक करने के तरीकों के विपरीत, Bइंद्रधनुष के अलग रंग शोधकर्ताओं क्लोन के बीच गतिशीलता का पालन करने की अनुमति देते हैं । इसके अतिरिक्त, मस्तिष्क के भीतर कई क्लोन लेबल करने के लिए Bइंद्रधनुष का उपयोग करके, क्लोनल व्यवहार पर अतिरिक्त डेटा तकनीकों के सापेक्ष एकत्र किया जाता है जो एक क्लोन11लेबल करते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि यहां वर्णित दृष्टिकोणों का विस्तार मछली के बीच विकासात्मक तुलना उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है जो18में विभिन्न आनुवंशिक या औषधीय जोड़तोड़ से गुजरे हैं। कुल मिलाकर, ये फायदे वर्सेब्रेट तंत्रिका तंत्र के विकास की खोज करने वाले शोधकर्ताओं के लिए जेब्राफिश आदर्श, विशेष रूप से क्लोन की भूमिका में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए बोइंद्रधनुष-व्यक्त जेब्राफिश आदर्श के वीवो कॉन्फोकल इमेजिंग में समय-चूक करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल विकासशील जेब्राफिश हिंदब्रेन में जनक कोशिकाओं और न्यूरॉन्स के क्लोन की कल्पना करने की एक विधि का वर्णन करता है और बोइंद्रधनुष और समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी11का उपयोग करके व?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम तकनीकी और बौद्धिक योगदान के लिए वाई ए पैन, जे Livet और जेड Tobias का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को नेशनल साइंस फाउंडेशन (अवार्ड 1553764) और एमजे मुर्डॉक चैरिटेबल ट्रस्ट ने सपोर्ट किया।
Materials
| 1.5mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 134020 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation |
| 50ml conical tubes | Corning | 352070 | For heat shocking embryos |
| 6 lb nylon fishing line | SecureLine | NMT250 | For making embryo manipulators |
| 7.5mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 135010 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | For E3 |
| Cotton swabs | Puritan | 867-WC NO GLUE | For making embryo manipulators |
| Cre recombinase | New England Biolabs | M0298M | |
| Digital dry bath | Genemate | 490016-616 | Used to store LMA at 40°C |
| Epifluorescence dissection scope | |||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Incubator | Forma Scientific | 3158 | To maintain embryos at 28°C |
| Injection plate molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Isotemp water bath | Fisher Scientific | 2320 | For heat shocking embryos |
| KCl | AMRESCO | 0395 | For E3 and for DNA solution for injections |
| Laser-scanning confocal microscope | Zeiss | LSM710 | |
| LE agarose | Genemate | E3120 | To create agarose injection plates |
| Low-melt agarose (LMA) | AMRESCO | J234 | |
| Mating tanks | Aquaneering, Inc. | ZHCT100 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | For E3 |
| MgSO4 | Sigma | 9397 | For E3 |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| MS-222 Tricaine-S | Western Chemical, Inc. | Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | For E3 |
| Petri dishes (90 mm, 60 mm) | Genesee Scientific | 32-107G | To house embryos and create imaging chamber (60 mm) |
| Phenol red | Sigma | P0290 | |
| Soft stitch ring markers | Clover Needlecraft, Inc. | 354 | For creating imaging chamber with Petri dish |
| Super glue (Ultra gel control) | Loctite | 1363589 | For making embryo manipulators |
| Syringe needles | Beckton Dickinson | BD329412 | For dechorionating embryos |
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