Visualisere den utviklende hjernen i levende sebrafisk ved hjelp av Brainbow og Time-lapse Confocal Imaging
Summary
In vivo imaging er et kraftig verktøy som kan brukes til å undersøke cellulære mekanismer underliggende nervesystemet utvikling. Her beskriver vi en teknikk for bruk av tidsforløp konfokal mikroskopi for å visualisere et stort antall flerfarget Brainbow-merkede celler i sanntid i det utviklende sebrafisknervesystemet.
Abstract
Utvikling av virveldyrnervesystemet krever en presis koordinering av kompleks cellulær atferd og interaksjoner. Bruken av høyoppløselige in vivo bildeteknikker kan gi et klart vindu inn i disse prosessene i den levende organismen. For eksempel kan deling av celler og deres avkom følges i sanntid som nervesystemet dannes. I de senere årene har tekniske fremskritt i flerfarget teknikker utvidet hvilke typer spørsmål som kan undersøkes. Den flerfargede Brainbow-tilnærmingen kan brukes til ikke bare å skille mellom like celler, men også til fargekode flere forskjellige kloner av relaterte celler som hver kommer fra en stamcelle. Dette gir mulighet for en multipleks avstamning analyse av mange forskjellige kloner og deres atferd samtidig under utviklingen. Her beskriver vi en teknikk for bruk av tidsforløp konfokal mikroskopi for å visualisere et stort antall flerfarget Brainbow-merkede celler over sanntid i det utviklende sebrafisknervesystemet. Dette er spesielt nyttig for å følge cellulære interaksjoner mellom som celler, som er vanskelig å merke differensialt ved hjelp av tradisjonelle promotordrevne farger. Vår tilnærming kan brukes til å spore avstamningrelasjoner mellom flere forskjellige kloner samtidig. De store datasettene som genereres ved hjelp av denne teknikken, gir rik informasjon som kan sammenlignes kvantitativt på tvers av genetiske eller farmakologiske manipulasjoner. Til syvende og sist kan resultatene som genereres bidra til å svare på systematiske spørsmål om hvordan nervesystemet utvikler seg.
Introduction
I de tidlige fasene av utviklingen deler bassenger av spesialiserte stamceller gjentatte ganger i proliferative soner, og produserer ulike arrayer av datterceller. Cellene som er født i denne utviklingsperioden vil da differensiere og reise for å danne de gryende organene. I nervesystemet gir stamfarer som radial glia opphav til umodne nevroner i ventrikulære soner. Som nevroner migrere bort fra ventrikler og modne, danner det ekspanderende vevet til slutt de svært komplekse strukturene i hjernen1,2,3,4,5,6. Koordineringen mellom deling av stamfarer og differensiering og migrasjon av nevroner vil bestemme den endelige størrelsen, formen og dermed funksjonen til hjernen, direkte påvirker atferd7,,8,9,10. Selv om tett kontroll over disse prosessene er klart avgjørende for normal hjerneutvikling, er de globale mekanismene som regulerer disse dynamikkene ikke godt forstått. Her beskriver vi et verktøy for å studere utvikling av nervesystemet ved en cellulær oppløsning, slik at forskere kan visualisere stamceller og nevroner in vivo i den utviklende sebrafiskhjernen med Brainbow og spore deres oppførsel over tid via tid-bortfall konfokal mikroskopi11. Tilnærmingen kan også tilpasses for å visualisere andre deler av det utviklende embryoet.
For å observere og skille mellom celler i den utviklende sebrafiskhjernen, har vi tilpasset Brainbow cellemerkingsteknikk11. Brainbow benytter det tilfeldig bestemte, kombinatoriske uttrykket av tre forskjellige fluorescerende proteiner (FPs) for å merke en populasjon av celler. Mens standarduttrykket for Brainbow-uttrykk er det røde FP dTomato, resulterer rekombinasjon av enzymet Cre rekombinase i uttrykk for mCerulean (cyan fluorescerende protein, CFP) eller gult fluorescerende protein (YFP)12,13. Den kombinerte mengden av hver FP uttrykt i en celle gir den en unik nyanse, slik at klart visuelt skille fra nærliggende celler. I tillegg, når en stamcelle deler seg, vil hver dattercelle arve fargen fra sin morcelle, produsere fargekodede kloner og tillate forskere å spore celleavstamning11,14. Mens den opprinnelig ble brukt til å analysere nevronale kretser i mus12,har Brainbow siden blitt uttrykt i et bredt spekter av modellorganismer, inkludert sebrafisk15.
Vår teknikk bygger på tidligere flerfarget merking og bildemetoder for å direkte bilde flere fargekodede kloner over tid i levende sebrafisk. På grunn av deres optiske gjennomsiktighet som embryoer, er sebrafisk godt egnet til bildeeksperimenter16, og tidligere studier har benyttet Brainbow i sebrafisk for å studere en rekke vev, inkludert nervesystemet11,,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Evnen til å direkte bilde inn i den levende organismen, sammen med deres raske ex utero utvikling, gjør sebrafisk til en verdifull modell for virveldyrutvikling. I motsetning til den pattedyrhjernen er hele proliferativ sone av sebrafisk hindbrain lett tilgjengelig for avbildning uten avbrudd i sitt endogene miljø6. Dette gjør det mulig å gjennomføre eksperimenter i den levende organismen, i stedet for in vitro eller faste vevspreparater. I motsetning til faste bildeeksperimenter tillater in vivo-studier en langsgående design, som produserer timer med data som kan analyseres for mønstre, og dermed øke sannsynligheten for å observere relativt sjeldne hendelser. Avhengig av hastigheten og lengden på hendelsene av interesse, forskere kan velge å utføre korte (1-2 t) eller lange (opp til ~ 16 h) time-lapse bildeforsøk. Ved å bruke sebrafisk varme sjokk promotoren 70 (hsp70, hsp), Brainbow uttrykk kan være tempolysk kontrollert28,29. I tillegg er mosaikkuttrykket indusert av denne arrangøren godt egnet for merking og sporing av mange kloner11.
Evnen til visuelt å identifisere flere kloner i den levende hjernen er en fordel med denne metoden. Viktige tidligere studier som undersøkte klonenes rolle i utviklingen av nervesystemet, benyttet retrovirale vektorer til å merke en enkelt stamcelle og dens avkom ved hjelp av en enkelt FP eller annet lett visualisert protein. Slik merking gjør det mulig for forskere å observere en enkelt klone over tid, enten in vitro eller in vivo2,30,31,32,33,34,35,36,37,38. I motsetning til metoder for å spore oppførselen til celler i en klone, de distinkte fargene i Brainbow tillate forskere å observere dynamikk blant kloner. I tillegg, ved å bruke Brainbow til å merke mange kloner i hjernen, samles ytterligere data om klonal atferd i forhold til teknikker som merker en enkelt klone11. Viktigere, tilnærmingene beskrevet her kan utvides til å generere utviklingssammenligninger mellom fisk som har gjennomgått forskjellige genetiske eller farmakologiske manipulasjoner18. Samlet sett gjør disse fordelene time-lapse in vivo confocal imaging av Brainbow-uttrykkende sebrafisk ideell for forskere som utforsker utviklingen av virveldyrnervesystemet, spesielt de som er interessert i kloners rolle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver en metode for å visualisere kloner av stamceller og nevroner i den utviklende sebrafisk hindbrain og følge dem in vivo ved hjelp av Brainbow og time-lapse confocal mikroskopi11. Den store fordelen med denne protokollen i forhold til in vitro eller ex vivo studier er evnen til å direkte observere den proliferative sonen av virveldyr hjernen i sitt naturlige miljø over tid. Denne teknikken bygger på tidligere studier som merket en enkelt klone ved hjelp av retroviral…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Y. A. Pan, J. Livet og Z. Tobias for tekniske og intellektuelle bidrag. Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation (Award 1553764) og M.J. Murdock Charitable Trust.
Materials
| 1.5mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 134020 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation |
| 50ml conical tubes | Corning | 352070 | For heat shocking embryos |
| 6 lb nylon fishing line | SecureLine | NMT250 | For making embryo manipulators |
| 7.5mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 135010 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | For E3 |
| Cotton swabs | Puritan | 867-WC NO GLUE | For making embryo manipulators |
| Cre recombinase | New England Biolabs | M0298M | |
| Digital dry bath | Genemate | 490016-616 | Used to store LMA at 40°C |
| Epifluorescence dissection scope | |||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Incubator | Forma Scientific | 3158 | To maintain embryos at 28°C |
| Injection plate molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Isotemp water bath | Fisher Scientific | 2320 | For heat shocking embryos |
| KCl | AMRESCO | 0395 | For E3 and for DNA solution for injections |
| Laser-scanning confocal microscope | Zeiss | LSM710 | |
| LE agarose | Genemate | E3120 | To create agarose injection plates |
| Low-melt agarose (LMA) | AMRESCO | J234 | |
| Mating tanks | Aquaneering, Inc. | ZHCT100 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | For E3 |
| MgSO4 | Sigma | 9397 | For E3 |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| MS-222 Tricaine-S | Western Chemical, Inc. | Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | For E3 |
| Petri dishes (90 mm, 60 mm) | Genesee Scientific | 32-107G | To house embryos and create imaging chamber (60 mm) |
| Phenol red | Sigma | P0290 | |
| Soft stitch ring markers | Clover Needlecraft, Inc. | 354 | For creating imaging chamber with Petri dish |
| Super glue (Ultra gel control) | Loctite | 1363589 | For making embryo manipulators |
| Syringe needles | Beckton Dickinson | BD329412 | For dechorionating embryos |
References
- Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
- Mcconnell, S. K. Constructing the Cerebral Cortex: Neurogenesis and Fate Determination Review. Neuron. 15, 761-768 (1995).
- Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish – from embryo to adult. Neural Development. 8, 3 (2013).
- Chenn, A., Walsh, C. Regulation of Cerebral Cortical Size by Control of Cell Cycle Exit in Neural Precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and Evolution of the Human Neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32, 1817-1828 (2013).
- Homem, C. C. F., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nature Reviews Neuroscience. 16 (11), 647-659 (2015).
- Brockway, N. L., et al. Multicolor lineage tracing using in vivo time-lapse imaging reveals coordinated death of clonally related cells in the developing vertebrate brain. Developmental Biology. 453 (2), 130-140 (2019).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
- Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Ko, S. K., Chen, X., Yoon, J., Shin, I. Zebrafish as a good vertebrate model for molecular imaging using fluorescent probes. Chemical Society Reviews. 40, 2120 (2011).
- Kesavan, G., Hammer, J., Hans, S., Brand, M. Targeted knock-in of CreERT2 in zebrafish using CRISPR/Cas9. Cell and Tissue Research. 372, 41-50 (2018).
- Cook, Z. T., et al. Combining near-infrared fluorescence with Brainbow to visualize expression of specific genes within a multicolor context. Molecular Biology of the Cell. 30 (4), 491-505 (2019).
- Kuwata, M., Nikaido, M., Hatta, K. Local heat-shock mediated multi-color labeling visualizing behaviors of enteric neural crest cells associated with division and neurogenesis in zebrafish gut. Developmental Dynamics. 248, 437-448 (2019).
- Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (3), 1164-1169 (2011).
- Heap, L. A., Goh, C. C., Kassahn, K. S., Scott, E. K. Cerebellar Output in Zebrafish: An Analysis of Spatial Patterns and Topography in Eurydendroid Cell Projections. Frontiers in Neural Circuits. 7, 53 (2013).
- Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise Lamination of Retinal Axons Generates Multiple Parallel Input Pathways in the Tectum. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
- Dirian, L., et al. Spatial Regionalization and Heterochrony in the Formation of Adult Pallial Neural Stem Cells. Developmental Cell. 30, 123-136 (2014).
- Chen, X. A., et al. Behavioral/Cognitive QRFP and Its Receptors Regulate Locomotor Activity and Sleep in Zebrafish. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1823-1840 (2016).
- Albadri, S., De Santis, F., Di Donato, V., Del Bene, F., Jaenisch, R., Zhang, F., Gage, F. CRISPR/Cas9-Mediated Knockin and Knockout in Zebrafish. Genome Editing in Neurosciences. , 41-49 (2017).
- Furlan, G., et al. Life-Long Neurogenic Activity of Individual Neural Stem Cells and Continuous Growth Establish an Outside-In Architecture in the Teleost Pallium. Current Biology. 27, 3288-3301 (2017).
- Herget, U., Arturo Gutierrez-Triana, J., Salazar Thula, O., Knerr, B., Ryu, S. Single-cell reconstruction of oxytocinergic neurons reveals separate hypophysiotropic and encephalotropic subtypes in larval zebrafish Brainbow-guided morphology of oxytocinergic cells. eNeuro. 4 (1), (2017).
- Halloran, M. C., et al. Laser-targeted gene expression. Development. 127, 1953-1960 (2000).
- Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50, 401-406 (2008).
- Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a Recombinant Retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
- Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104, 473-482 (1988).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-441 (1992).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Clonal dispersion in proliferative layers of developing cerebral cortex. Nature. 362 (6421), 632-635 (1993).
- Cai, L., Hayes, N. L., Nowakowski, R. S. Synchrony of Clonal Cell Proliferation and Contiguity of Clonally Related Cells: Production of Mosaicism in the Ventricular Zone of Developing Mouse Neocortex. The Journal of Neuroscience. 17 (6), 2088-2100 (1997).
- Reznikov, K., Acklin, S. E., Van Der Kooy, D. Clonal Heterogeneity in the Early Embryonic Rodent Cortical Germinal Zone and the Separation of Subventricular From Ventricular Zone Lineages. Developmental Dynamics. 210, 328-343 (1997).
- Qian, X., Goderie, S., Shen, Q., Stern, J., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125, 3143-3152 (1998).
- McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic Neural Progenitors Appear to Be Restricted to Regional and Glial Fates before the Onset of Neurogenesis. The Journal of Neuroscience. 21 (17), 6772-6781 (2001).
- Yu, Y. C., Bultje, R. S., Wang, X., Shi, S. H. Specific synapses develop preferentially among sister excitatory neurons in the neocortex. Nature. 458 (7237), 501-504 (2009).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish Breeding in the Laboratory Environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. 25, e1115 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- R Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2017).
- Smith, M. R. . Ternary: an R package to generate ternary plots. , (2017).
- Baye, L. M., Link, B. A. Development/Plasticity/Repair Interkinetic Nuclear Migration and the Selection of Neurogenic Cell Divisions during Vertebrate Retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
- Leung, L., Klopper, A. V., Grill, S. W., Harris, W. A., Norden, C. Apical migration of nuclei during G2 is a prerequisite for all nuclear motion in zebrafish neuroepithelia. Development. 139, 2635 (2012).
- Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H., Curriet, A. R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wide-ranging Implications in Tissue Kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239 (1972).
- Cole, L. K., Ross, L. S. Apoptosis in the Developing Zebrafish Embryo. Developmental Biology. 240, 123-142 (2001).
- Liao, J., He, J., Yan, T., Korzh, V., Gong, Z. A Class of NeuroD-Related Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Expressed in Developing Central Nervous System in Zebrafish. DNA and Cell Biology. 18 (4), 333-344 (1999).
- Trevarrow, B., Marks, D. L., Kimmel, C. B. Organization of hindbrain segments in the zebrafish embryo. Neuron. 4 (5), 669-679 (1990).
- Yabu, T., Todoriki, S., Yamashita, M. Stress-induced apoptosis by heat shock, UV and gamma-ray irradiation in zebrafish embryos detected by increased caspase activity and whole-mount TUNEL staining. Fisheries Science. 67, 333-340 (2001).
