Visualisera utveckla hjärnan i levande zebrafisk med Brainbow och Time-lapse Confocal Imaging

Summary

In vivo imaging är ett kraftfullt verktyg som kan användas för att undersöka de cellulära mekanismerna bakom nervsystemet utveckling. Här beskriver vi en teknik för att använda time-lapse confocal mikroskopi för att visualisera ett stort antal multicolor Brainbow-märkta celler i realtid inom den växande zebrafish nervsystemet.

Abstract

Utveckling av ryggradsdjur nervsystemet kräver en exakt samordning av komplexa cellulära beteenden och interaktioner. Användningen av högupplösta in vivo bildtekniker kan ge ett tydligt fönster in i dessa processer i den levande organismen. Till exempel kan dela celler och deras avkomma följas i realtid som nervsystemet bildas. Under de senaste åren har tekniska framsteg inom multicolor tekniker utökat de typer av frågor som kan undersökas. Den multicolor Brainbow metoden kan användas för att inte bara skilja mellan liknande celler, men också att färgkod flera olika kloner av relaterade celler som var och en härrör från en stamcell. Detta möjliggör en multiplex härstamning analys av många olika kloner och deras beteenden samtidigt under utveckling. Här beskriver vi en teknik för att använda time-lapse confocal mikroskopi för att visualisera ett stort antal multicolor Brainbow-märkta celler över realtid inom den växande zebrafish nervsystemet. Detta är särskilt användbart för att följa cellulära interaktioner mellan liknande celler, som är svåra att märka differentiellt med traditionella promotordrivna färger. Vår metod kan användas för att spåra härstamning relationer mellan flera olika kloner samtidigt. De stora datamängder som genereras med hjälp av denna teknik ger omfattande information som kan jämföras kvantitativt över genetiska eller farmakologiska manipulationer. I slutändan de resultat som genereras kan bidra till att svara på systematiska frågor om hur nervsystemet utvecklas.

Introduction

I de tidiga utvecklingsfaserna delar sig pooler av specialiserade stamceller upprepade gånger i proliferativa zoner, vilket producerar olika matriser av dotterceller. De celler som föds under denna utvecklingsperiod kommer sedan att differentiera och resa för att bilda de begynnande organen. I nervsystemet, förfäder såsom radiell glia ge upphov till omogna nervceller i ventrikulära zoner. Som nervceller migrera bort från ventriklarna och mogna, den expanderande vävnaden bildar så småningom de mycket komplexa strukturerna i hjärnan^1,2,3,4,5,6. Samordningen mellan uppdelning av stamfader och differentiering och migration av nervceller kommer att avgöra den slutliga storleken, formen, och därmed funktionen av hjärnan, direkt påverkar beteende^7,8,9,10. Även om snäv kontroll över dessa processer är helt klart avgörande för normal hjärnans utveckling, de globala mekanismer som reglerar dessa dynamik är inte väl förstådda. Här beskriver vi ett verktyg för att studera nervsystemet utveckling på en cellulär upplösning, så att forskare att visualisera stamceller och nervceller in vivo i utvecklingen zebrafish hjärnan med Brainbow och spåra deras beteende över tiden via time-lapse confocal mikroskopi¹¹. Tillvägagångssättet kan också anpassas för att visualisera andra delar av det utvecklande embryot.

För att observera och skilja mellan celler i den utvecklande zebrafiskhjärna har vi anpassat Brainbow cellmärkningsteknik¹¹. Brainbow använder slumpmässigt bestämd, kombinatoriskt uttryck för tre distinkta fluorescerande proteiner (FPs) för att märka en population av celler. Medan standarduttrycket för Brainbow uttryck är den röda FP dTomato, återkombinering av enzymet Cre recombinase resulterar i uttryck för mCerulean (cyan fluorescerande protein, CFP) eller gult fluorescerande protein (YFP)^12,13. Den sammanlagda mängden av varje FP uttryckt i en cell ger det en unik nyans, vilket möjliggör tydlig visuell åtskillnad från angränsande celler. Dessutom, när en stamcell delar sig, varje dotter cell kommer att ärva färgen från sin modercell, producerar färgkodade kloner och tillåter forskare att spåra cell härstamning^11,14. Medan ursprungligen används för att analysera neuronala kretsar hos möss¹², Brainbow har sedan dess uttryckts i en mängd olika modellorganismer, inklusive zebrafisk¹⁵.

Vår teknik bygger på tidigare multicolor märkning och bildframställning metoder för att direkt bild flera färgkodade kloner över tiden i levande zebrafisk. På grund av deras optiska öppenhet som embryon, zebrafisk är väl lämpade för bildbehandling experiment¹⁶, och tidigare studier har använt Brainbow i zebrafiskar att studera en mängd olika vävnader, inklusive nervsystemet^{11,15,17,18,19,20,21,22,23,,24,25, 26,27}. Förmågan att direkt avbilda in i den levande organismen, tillsammans med deras snabba ex utero utveckling, gör zebrafisk en värdefull modell av ryggradsdjur utveckling. I motsats till däggdjurshjärnan är hela den proliferative zonen i zebrafisk hindbrain lätt tillgänglig för avbildning utan avbrott i dess endogena miljö⁶. Detta gör det möjligt att genomföra experiment i den levande organismen, snarare än i in vitro- eller fasta vävnadspreparat. I motsats till fasta bildframställning experiment, in vivo studier möjliggör en longitudinell design, producerar timmar av data som kan analyseras för mönster, vilket ökar sannolikheten för att observera relativt sällsynta händelser. Beroende på hastigheten och längden på händelser av intresse, kan forskarna välja att utföra korta (1-2 h) eller långa (upp till ~ 16 h) time-lapse imaging experiment. Genom att använda zebrafisk värme chock promotor 70 (hsp70, hsp), Brainbow uttryck kan vara tidsmässigt kontrolleras^28,29. Dessutom är mosaik uttryck framkallas av denna promotor väl lämpad för märkning och spåra många kloner¹¹.

Förmågan att visuellt identifiera flera kloner i den levande hjärnan är en fördel med denna metod. Viktiga tidigare studier som undersökte klonernas roll inom utvecklingen av nervsystemet använde retrovirala vektorer för att märka en enda stamcell och dess avkomma med hjälp av ett enda FP eller annat lätt visualiserat protein. En sådan märkning gör det möjligt för forskare att observera en enda klon över tiden, antingen in vitro eller in vivo^{2,,30,,31,,32,,33,,34,,35,,36,,37,38}. I motsats till metoder för att spåra beteendet hos celler inom en klon, de distinkta färgerna i Brainbow tillåter forskare att observera dynamiken bland kloner. Dessutom, genom att använda Brainbow att märka många kloner i hjärnan, ytterligare data om kloniska beteende samlas in i förhållande till tekniker som etikett en enda klon¹¹. Viktigt, de metoder som beskrivs här kan utökas för att generera utvecklingsmässiga jämförelser mellan fisk som har genomgått olika genetiska eller farmakologiska manipulationer¹⁸. Sammantaget gör dessa fördelar time-lapse in vivo confocal imaging av Brainbow-uttrycker zebrafisk idealisk för forskare utforska utvecklingen av ryggradsdjur nervsystemet, särskilt de som är intresserade av rollen som kloner.

Protocol

Försök med djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Lewis & Clark College. 1. Mikroinjektion av Zebrafish Embryon Ställ in vild typ, vuxna zebrafiskar i könssegregerade parningstankar på eftermiddagen innan du utför mikroinjektioner39,40. Förbered DNA-lösningen på morgonen av mikroinjektionerna. Späd hsp: Zebrabow11 plasmid DNA t…

Representative Results

Det här avsnittet illustrerar exempel på resultat som kan erhållas med hjälp av in vivo multicolor time-lapse imaging metod som beskrivs här. Vi visar att Brainbow färgkodade kloner av celler i proliferative Ventrikulärt zonen i den växande zebrafish hindbrain14 (Figur 1). Typiskt, när Brainbow-märkta celler arrangerades längs en viss radiell fiber, delade de samma färg (figur 1D), som kan kvantifie…

Discussion

Detta protokoll beskriver en metod för att visualisera kloner av stamceller och nervceller i utvecklingen zebrafisk hindbrain och följa dem in vivo med Brainbow och time-lapse confocal mikroskopi¹¹. Den största fördelen med detta protokoll i jämförelse med in vitro- eller ex vivo-studier är förmågan att direkt observera den proliferativa zonen av ryggradsdjur hjärnan i sin naturliga miljö över tiden. Denna teknik bygger på tidigare studier som märkt en enda klon med retrovirala vekto…

Materials

1.5mL transfer pipet	Globe Scientific, Inc.	134020
1-phenyl-2-thiourea (PTU)	Alfa Aesar	L06690	Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation
50ml conical tubes	Corning	352070	For heat shocking embryos
6 lb nylon fishing line	SecureLine	NMT250	For making embryo manipulators
7.5mL transfer pipet	Globe Scientific, Inc.	135010
CaCl2	Sigma	C3881	For E3
Cotton swabs	Puritan	867-WC NO GLUE	For making embryo manipulators
Cre recombinase	New England Biolabs	M0298M
Digital dry bath	Genemate	490016-616	Used to store LMA at 40°C
Epifluorescence dissection scope
Glass capillary tubes	World Precision Instruments	TW100F-4
Incubator	Forma Scientific	3158	To maintain embryos at 28°C
Injection plate molds	Adaptive Science Tools	TU-1
Isotemp water bath	Fisher Scientific	2320	For heat shocking embryos
KCl	AMRESCO	0395	For E3 and for DNA solution for injections
Laser-scanning confocal microscope	Zeiss	LSM710
LE agarose	Genemate	E3120	To create agarose injection plates
Low-melt agarose (LMA)	AMRESCO	J234
Mating tanks	Aquaneering, Inc.	ZHCT100
Methylene blue	Sigma	M9140	For E3
MgSO4	Sigma	9397	For E3
Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
MS-222 Tricaine-S	Western Chemical, Inc.		Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos
NaCl	J.T. Baker	4058-01	For E3
Petri dishes (90 mm, 60 mm)	Genesee Scientific	32-107G	To house embryos and create imaging chamber (60 mm)
Phenol red	Sigma	P0290
Soft stitch ring markers	Clover Needlecraft, Inc.	354	For creating imaging chamber with Petri dish
Super glue (Ultra gel control)	Loctite	1363589	For making embryo manipulators
Syringe needles	Beckton Dickinson	BD329412	For dechorionating embryos