Udførelse af koloskopisk-guidet knivspids biopsier i mus og evaluering af efterfølgende vævsændringer
Summary
Her giver vi en detaljeret beskrivelse af proceduren for at fremkalde koloskopiske-guidede knivspids biopsier hos mus og spore sårlukning i realtid. Derudover findes der metoder til fremstilling af væv til histologiske, immuntoksikologiske og molekylære analyser af sårbunden.
Abstract
Forståelse af væv og cellulære ændringer, der opstår i akut skade respons samt under sårheling processen er af afgørende betydning, når de studerer sygdomme i mave-tarmkanalen (GI) tarmkanalen. Den murin colon knivspids biopsi model er et nyttigt redskab til at definere disse processer. Derudover kan samspillet mellem tarm luminal indhold (f.eks mikrober) og tyktarmen studeres. Men sårinduktion og evnen til at spore sår lukning over tid på en pålidelig måde kan være udfordrende. Desuden skal vævsforberedelse og orientering udføres på en standardiseret måde for optimalt at afhøre histologiske og molekylære ændringer. Her præsenterer vi en detaljeret metode, der beskriver biopsi-induceret skade og overvågning af sårlukning gennem gentagne koloskopier. En tilgang er beskrevet, der sikrer konsekvente og reproducerbare målinger af sårstørrelse, evnen til at indsamle sårbunden til molekylære analyser samt visualisere sårbunden ved sektion af væv. Evnen til at udføre disse teknikker med succes giver mulighed for undersøgelser af den akutte skade respons, sårheling og luminal-host interaktioner i tyktarmen.
Introduction
Mave-tarmkanalen (GI) er et komplekst organsystem på grund af dets mange funktioner, værtscelletyper (f.eks. epitel, immun, stromal osv.) samt billioner af mikrober. I lyset af denne kompleksitet involverer sygdomme i mave-tarmkanalen ofte samspillet mellem alle disse faktorer. For eksempel er inflammatoriske tarmsygdomme (IBD) forbundet med cyklusser af betændelse og remission i MAVE-tarmkanalen, der involverer aktivering af inflammatoriske celler, dysbiose og epitelreparation1,2,3,4,5,6,7. At have passende modelsystemer til at studere IBD og andre inflammatoriske tilstande i mave-tarmkanalen er afgørende for at belyse sygdomspatogenese. Der findes flere modeller til undersøgelse af IBD-patogenese, herunder gensplejsede mus og anvendelse af kemikalier som dextrannatriumsulfat (DSS) hos gnavere8,9,10. Begrænsninger af disse modeller omfatter en manglende evne til præcist at kontrollere induktion af inflammation samt vanskeligheder med at evaluere sårheling. Alternative metoder til at efterligne aspekter af IBD patogenese kan vise sig nyttige til udvikling af behandlinger.
Koloskopisk-guidede knivspids biopsier i mus tilbyder et nyttigt modelsystem til at studere patogenese af den inflammatoriske respons, sårheling, samt vært-mikrobe interaktioner i tyktarmen. Denne tilgang blev først brugt som et eksperimentelt værktøj i 2009, som demonstrerede dets nytte for at studere den akutte inflammatoriske respons og sårheling i tarmen11. Efterfølgende undersøgelser udnyttet denne teknik til at evaluere roller forskellige signalering veje samt tarmen mikrobiota, i colon sårheling11,12,13,14,15,16,17,18. For nylig brugte vores gruppe denne model til at undersøge vigtigheden af sphingosin-1-fosfatsignalering og bakterier i den akutte reaktion på tyktarmsskade19. Selvom det er nyttigt, kan det være teknisk udfordrende at udføre koloskopiske-styrede knivspidsbiopsier hos mus og evaluere efterfølgende vævsændringer. For eksempel kan perforering af tarmen forekomme ved induktion af skade og sikre konsekvente målinger af sårbunden gennem serielle koloskopier kan være svært. Derudover kan det være udfordrende at orientere det colon væv korrekt for at visualisere sårbunden til histologiske eller immunohistokemiske analyser. Selv om nogle oplysninger findes om disse metoder18,20, en præcis trinvis beskrivelse af disse teknikker langs vil visuelle hjælpemidler lover at forbedre pålideligheden og bredere nytte af denne model. Her præsenterer vi en detaljeret metode til at udføre koloskopiske-guidede knivspids biopsier hos mus, spore sårlukning over tid og forberede vævet for at muliggøre histologiske og molekylære analyser af sårbunden. Oprettelse af en standard metode til at udføre disse teknikker kan udvide brugen af denne model til at studere tidligere uundersøgte mæglere, der er potentielt vigtige for GI inflammation og sår reparation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sikring af konsistente og nøjagtige biopsier samt målinger af sårstørrelse er af afgørende betydning, når man forsøger effektivt at vurdere hastigheden af sårlukning i denne model. Der bør derfor træffes flere foranstaltninger for at være sikre på, at procedurerne gennemføres korrekt. For det første må dybden af biopsi ikke være for lav eller dyb. Hvis det er for lavt, vil der ikke være et tilstrækkeligt vindue til at evaluere sårlukning. Figur 2 viser en optimal biopsidyb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Crohn’s og Colitis Foundation (D.C.M) og New York Crohn’s Foundation (D.C.M. og AJD). Forfatterne takker Ms Carmen Ferrara for hjælp til at skabe video akkompagnement til denne artikel.
Materials
| Biopsy forceps, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
| Coloview Tower system | Karl Storz | contact company | |
| Examination sheath, 9 Fr, Kit | Karl Storz | 61029DK | |
| Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
| isofluorane | Covetrus | 2905 | |
| methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| micro iris scissors | Integra | 18-1619 | |
| NIH ImageJ | NIH | N/A | software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Pawfly MA-60 aquarium pump | Amazon | N/A | |
| scalpal with #10 blade | Hill-Rom | 372610 |
References
- Boal Carvalho, P., Cotter, J. Mucosal Healing in Ulcerative Colitis: A Comprehensive Review. Drugs. 77 (2), 159-173 (2017).
- Chen, M. L., Sundrud, M. S. Cytokine Networks and T-Cell Subsets in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (5), 1157-1167 (2016).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Halfvarson, J., et al. Dynamics of the human gut microbiome in inflammatory bowel disease. Nature Microbiology. 2, 17004 (2017).
- Johansson, M. E., et al. Bacteria penetrate the normally impenetrable inner colon mucus layer in both murine colitis models and patients with ulcerative colitis. Gut. 63 (2), 281-291 (2014).
- Luissint, A. C., Parkos, C. A., Nusrat, A. Inflammation and the Intestinal Barrier: Leukocyte-Epithelial Cell Interactions, Cell Junction Remodeling, and Mucosal Repair. Gastroenterology. 151 (4), 616-632 (2016).
- Pineton de Chambrun, G., Blanc, G., Peyrin-Biroulet, L. Current evidence supporting mucosal healing and deep remission as important treatment goals for inflammatory bowel disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 10 (8), 915-927 (2016).
- Fung, K. Y., Putoczki, T. In Vivo Models of Inflammatory Bowel Disease and Colitis-Associated Cancer. Methods in Molecular Biology. 1725, 3-13 (2018).
- Jurjus, A. R., Khoury, N. N., Reimund, J. M. Animal models of inflammatory bowel disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (2), 81-92 (2004).
- Mizoguchi, A., Takeuchi, T., Himuro, H., Okada, T., Mizoguchi, E. Genetically engineered mouse models for studying inflammatory bowel disease. Journal of Pathology. 238 (2), 205-219 (2016).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (1), 256-261 (2009).
- Alam, A., et al. The microenvironment of injured murine gut elicits a local pro-restitutive microbiota. Nature Microbiology. 1, 15021 (2016).
- Alam, A., et al. Redox signaling regulates commensal-mediated mucosal homeostasis and restitution and requires formyl peptide receptor 1. Mucosal Immunology. 7 (3), 645-655 (2014).
- Kuhn, K. A., Manieri, N. A., Liu, T. C., Stappenbeck, T. S. IL-6 stimulates intestinal epithelial proliferation and repair after injury. PLoS One. 9 (12), 114195 (2014).
- Leoni, G., et al. Annexin A1, formyl peptide receptor, and NOX1 orchestrate epithelial repair. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 443-454 (2013).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139 (6), 1837-1843 (2010).
- Montrose, D. C., et al. Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice as a Useful Model for Evaluating the Roles of Host and Luminal Factors in Colonic Inflammation. American Journal of Pathology. 188 (12), 2811-2825 (2018).
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. Journal of Visualized Experiments. (90), (2014).
