Esecuzione di biopsie di avvicinamento delle dita guidate dal colonscopico nei topi e valutazione dei successivi cambiamenti tissutali
Summary
Qui, forniamo una descrizione dettagliata della procedura per indurre biopsie di pizzico guidate dal colonscopico nei topi e tracciare la chiusura delle ferite in tempo reale. Inoltre, vengono forniti metodi per la preparazione di tessuti per analisi istologiche, immunoistochimiche e molecolari del letto della ferita.
Abstract
Comprendere i cambiamenti tissutali e cellulari che si verificano nella risposta alle lesioni acute e durante il processo di guarigione delle ferite è di fondamentale importanza quando si studiano le malattie del tratto gastrointestinale (IG). Il modello di biopsia a pizzico colonico murino è uno strumento utile per definire questi processi. Inoltre, è possibile studiare l’interazione tra il contenuto luminale intestinale (ad esempio, microbi) e il colon. Tuttavia, l’induzione della ferita e la capacità di tracciare la chiusura della ferita nel tempo in modo affidabile possono essere impegnative. Inoltre, la preparazione e l’orientamento dei tessuti devono essere effettuati in modo standardizzato per interrogare in modo ottimale i cambiamenti istologici e molecolari. Qui presentiamo un metodo dettagliato che descrive le lesioni indotte dalla biopsia e il monitoraggio della chiusura delle ferite attraverso colonscopie ripetute. Viene descritto un approccio che garantisce misurazioni coerenti e riproducibili delle dimensioni della ferita, la capacità di raccogliere il letto della ferita per analisi molecolari e visualizzare il letto della ferita al momento della sessatura dei tessuti. La capacità di eseguire con successo queste tecniche consente studi sulla risposta acuta alle lesioni, sulla guarigione delle ferite e sulle interazioni luminare-ospite all’interno del colon.
Introduction
Il tratto gastrointestinale (GI) è un sistema di organi complesso date le sue molteplici funzioni, i tipi di cellule ospiti (ad esempio epiteliale, immunitario, stromale, ecc.) e trilioni di microbi. Alla luce di questa complessità, le malattie del tratto gastrointestinale spesso comportano l’interazione di tutti questi fattori. Ad esempio, le malattie infiammatorie intestinali (IBD) sono associate a cicli di infiammazione e remissione nel tratto gastrointestinale, che comportano l’attivazione di cellule infiammatorie, disbiosi e riparazione epiteliale1,2,3,4,5,6,7. Avere sistemi modello appropriati per studiare l’IBD e altre condizioni infiammatorie del tratto GASTROINTESTINAL è fondamentale per chiarire la patogenesi della malattia. Esistono diversi modelli per studiare la patogenesi IBD, compresi i topi geneticamente modificati e l’uso di sostanze chimiche come il solfato di sodio di dextran (DSS)nei roditori 8,9,10. Le limitazioni di questi modelli includono l’incapacità di controllare con precisione l’induzione dell’infiammazione e le difficoltà nel valutare la guarigione delle ferite. Metodi alternativi per imitare aspetti della patogenesi IBD potrebbero rivelarsi utili per lo sviluppo di terapie.
Le biopsie di pizzico guidate dal colonscopico nei topi offrono un utile sistema modello per studiare la patogenesi della risposta infiammatoria, la guarigione delle ferite e le interazioni ospite-microbo nel colon. Questo approccio è stato utilizzato per la prima volta come strumento sperimentale nel 2009, che ha dimostrato la sua utilità per lo studio della risposta infiammatoria acuta e della guarigione delle feritenell’intestino 11. Studi successivi hanno utilizzato questa tecnica per valutare i ruoli delle diverse vie di segnalazione così come il microbiota intestinale, nella guarigione delle ferite coloniche11,12,13,14,15,16,17,18. Più recentemente, il nostro gruppo ha utilizzato questo modello per studiare l’importanza della segnalazione della sfingosina-1-fosfato e dei batteri nella risposta acuta alla lesionecolonica 19. Sebbene utile, effettuare biopsie di pizzico guidate dal colonscopico nei topi e valutare i successivi cambiamenti tissutali può essere tecnicamente impegnativo. Ad esempio, la perforazione dell’intestino può verificarsi all’induzione di lesioni e garantire misurazioni coerenti del letto della ferita attraverso colonscopie seriali può essere difficile. Inoltre, orientare correttamente il tessuto colon per visualizzare il letto della ferita per analisi istologiche o immunoistochimiche può essere impegnativo. Sebbene esistano alcune informazioni su questi metodi18,20, una descrizione precisa di queste tecniche insieme agli ausili visivi promette di migliorare l’affidabilità e l’utilità più ampia di questo modello. Qui presentiamo un metodo dettagliato per effettuare biopsie di pizzico guidate colonscopiche nei topi, tracciare la chiusura delle ferite nel tempo e preparare il tessuto per consentire analisi istologiche e molecolari del letto della ferita. La creazione di un metodo standard per eseguire queste tecniche può espandere l’uso di questo modello per studiare mediatori precedentemente non investiti che sono potenzialmente importanti per l’infiammazione dell’IG e la riparazione delle ferite.
Protocol
Representative Results
Discussion
Garantire biopsie coerenti e accurate e misurazioni delle dimensioni della ferita sono di fondamentale importanza quando si tenta di valutare efficacemente il tasso di chiusura delle ferite in questo modello. Pertanto, si dovrebbero adottare diverse misure per essere sicuri che le procedure siano state eseguite correttamente. In primo luogo, la profondità della biopsia non deve essere troppo bassa o profonda. Se troppo superficiale, non ci sarà una finestra sufficiente per valutare la chiusura della ferita. <strong cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Crohn’s and Colitis Foundation (D.C.M) e della New York Crohn’s Foundation (D.C.M. e A.J.D.). Gli autori ringraziano la Signora Carmen Ferrara per l’assistenza nella creazione del video accompagnamento a questo articolo.
Materials
| Biopsy forceps, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
| Coloview Tower system | Karl Storz | contact company | |
| Examination sheath, 9 Fr, Kit | Karl Storz | 61029DK | |
| Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
| isofluorane | Covetrus | 2905 | |
| methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| micro iris scissors | Integra | 18-1619 | |
| NIH ImageJ | NIH | N/A | software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Pawfly MA-60 aquarium pump | Amazon | N/A | |
| scalpal with #10 blade | Hill-Rom | 372610 |
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