Farelerde Kolonoskopik Güdümlü Çimdik Biyopsilerinin Yapılması ve Sonraki Doku Değişikliklerinin Değerlendirilmesi
Summary
Burada, farelerde kolonoskopik güdümlü çimdik biyopsilerini indüklemek ve yara kapanışını gerçek zamanlı olarak izlemek için prosedürün ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz. Ayrıca yara yatağının histolojik, immünohistokimyasal ve moleküler analizleri için dokuların hazırlanması için yöntemler sağlanmaktadır.
Abstract
Gastrointestinal (GI) sistem hastalıkları incelerken akut yaralanma yanıtının yanı sıra yara iyileşme sürecinde meydana gelen doku ve hücresel değişikliklerin anlaşılması son derece önemlidir. Murine kolonik çimdik biyopsi modeli bu süreçleri tanımlamak için yararlı bir araçtır. Ayrıca, bağırsak parlak içeriği (örneğin, mikroplar) ve kolon arasındaki etkileşim incelenebilir. Bununla birlikte, yara indüksiyonu ve zaman içinde yara kapatmayı güvenilir bir şekilde takip etme yeteneği zor olabilir. Ayrıca, histolojik ve moleküler değişiklikleri en iyi şekilde sorgulamak için doku hazırlama ve yönlendirme standart bir şekilde yapılmalıdır. Burada biyopsi kaynaklı yaralanmayı ve tekrarlayan kolonoskopiler yoluyla yara kapatmanın izlenmesini anlatan ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz. Yara boyutunun tutarlı ve tekrarlanabilir ölçümlerini, moleküler analizler için yara yatağını toplama yeteneğini ve dokuların kesitleri üzerine yara yatağını görselleştirmeyi sağlayan bir yaklaşım tanımlanmıştır. Bu teknikleri başarıyla yerine getirme yeteneği, kolon içindeki akut yaralanma yanıtı, yara iyileşmesi ve luminal konak etkileşimlerinin çalışmalarına izin verir.
Introduction
Gastrointestinal (GI) sistem, birden fazla işlevi, konak hücre tipleri (örneğin epitel, bağışıklık, stromal vb.) ve trilyonlarca mikrop göz önüne alındığında karmaşık bir organ sistemidir. Bu karmaşıklığın ışığında, GI kanalı hastalıkları genellikle tüm bu faktörlerin etkileşimini içerir. Örneğin, enflamatuar bağırsak hastalıkları (IBD), enflamatuar hücrelerin aktivasyonunu, disbiyozu ve epitel onarımı 1, 2 ,3,4,5,6,7‘yi içeren GI kanalında iltihaplanma ve remisyon döngüleri ile ilişkilidir. GI sisteminin IBD ve diğer enflamatuar durumlarını incelemek için uygun model sistemlerine sahip olmak, hastalığın patogenezini emmek için kritik öneme sahiptir. Genetik olarak tasarlanmış fareler ve kemirgenlerde dektran sodyum sülfat (DSS) gibi kimyasalların kullanımı da dahil olmak üzere IBD patogenezini incelemek için çeşitli modellervardır 8,9,10. Bu modellerin sınırlamaları, iltihabın indüksiyonunu hassas bir şekilde kontrol edememenin yanı sıra yara iyileşmesini değerlendirmede zorluklar içerir. IBD patogenezinin yönlerini taklit etmek için alternatif yöntemler tedaviler geliştirmek için yararlı olabilir.
Farelerde kolonoskopik güdümlü çimdik biyopsileri, enflamatuar yanıtın patogenezini, yara iyileşmesini ve kolondaki konak mikrop etkileşimlerini incelemek için yararlı bir model sistemi sunar. Bu yaklaşım ilk olarak 2009 yılında akut inflamatuar yanıtı ve bağırsaktaki yara iyileşmesini incelemek için yardımcılığını gösteren deneysel bir araç olarak kullanılmıştır11. Daha sonrakiçalışmalar, kolon yaraiyileşmesinde 11 , 12 , 13 , 14 , 15,16,17,18‘de bağırsak mikrobiyotasının yanı sıra farklı sinyal yollarının rollerini değerlendirmek için bu tekniği kullandı. Daha yakın zamanda, grubumuz kolon hasarına akut yanıtta sphingosine-1-fosfat sinyalinin ve bakterilerin önemini araştırmak için bu modeli kullandı19. Yararlı olmasına rağmen, farelerde kolonoskopik güdümlü çimdik biyopsileri yapmak ve sonraki doku değişikliklerini değerlendirmek teknik olarak zor olabilir. Örneğin, yaralanmanın indüksiyonu üzerine bağırsağın delinmesinin gerçekleşmesi ve seri kolonoskopiler yoluyla yara yatağının tutarlı ölçümlerinin sağlanması zor olabilir. Ek olarak, histolojik veya immünohistokimyasal analizler için yara yatağını görselleştirmek için kolonik dokuyu düzgün bir şekilde yönlendirmek zor olabilir. Her ne kadar bu yöntemlerle ilgili bazı bilgiler mevcut olsa da18,20Bu tekniklerin kesin bir adım açısından açıklaması, bu modelin güvenilirliğini ve daha geniş yararını geliştirmeyi vaat eden görsel yardımlar sağlayacaktır. Burada, farelerde kolonoskopik güdümlü çimdik biyopsileri yapmak, zamanla yara kapatmayı izlemek ve yara yatağının histolojik ve moleküler analizlerini sağlamak için dokuyu hazırlamak için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz. Bu teknikleri gerçekleştirmek için standart bir yöntem oluşturmak, GI iltihabı ve yara onarımı için potansiyel olarak önemli olan daha önce araştırılmamış arabulucuları incelemek için bu modelin kullanımını genişletebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu modelde yara kapatma oranını etkili bir şekilde değerlendirmeye çalışırken tutarlı ve doğru biyopsilerin yanı sıra yara büyüklüğü ölçümlerinin sağlanması son derece önemlidir. Bu nedenle, prosedürlerin doğru şekilde yürütüldüğünden emin olmak için çeşitli önlemler alınmalıdır. İlk olarak, biyopsinin derinliği çok sığ veya derin olmamalıdır. Çok sığsa, yara kapatmayı değerlendirmek için yeterli bir pencere olmayacaktır. Şekil 2, 0. gün…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Crohn’s and Colitis Foundation (D.C.M) ve New York Crohn’s Foundation (D.C.M. ve A.J.D.) tarafından desteklendi. Yazarlar, bayan Carmen Ferrara’ya bu makalenin video eşlikini oluşturmada yardımcı olduğu için teşekkür ediyor.
Materials
| Biopsy forceps, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
| Coloview Tower system | Karl Storz | contact company | |
| Examination sheath, 9 Fr, Kit | Karl Storz | 61029DK | |
| Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
| isofluorane | Covetrus | 2905 | |
| methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| micro iris scissors | Integra | 18-1619 | |
| NIH ImageJ | NIH | N/A | software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Pawfly MA-60 aquarium pump | Amazon | N/A | |
| scalpal with #10 blade | Hill-Rom | 372610 |
References
- Boal Carvalho, P., Cotter, J. Mucosal Healing in Ulcerative Colitis: A Comprehensive Review. Drugs. 77 (2), 159-173 (2017).
- Chen, M. L., Sundrud, M. S. Cytokine Networks and T-Cell Subsets in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (5), 1157-1167 (2016).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Halfvarson, J., et al. Dynamics of the human gut microbiome in inflammatory bowel disease. Nature Microbiology. 2, 17004 (2017).
- Johansson, M. E., et al. Bacteria penetrate the normally impenetrable inner colon mucus layer in both murine colitis models and patients with ulcerative colitis. Gut. 63 (2), 281-291 (2014).
- Luissint, A. C., Parkos, C. A., Nusrat, A. Inflammation and the Intestinal Barrier: Leukocyte-Epithelial Cell Interactions, Cell Junction Remodeling, and Mucosal Repair. Gastroenterology. 151 (4), 616-632 (2016).
- Pineton de Chambrun, G., Blanc, G., Peyrin-Biroulet, L. Current evidence supporting mucosal healing and deep remission as important treatment goals for inflammatory bowel disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 10 (8), 915-927 (2016).
- Fung, K. Y., Putoczki, T. In Vivo Models of Inflammatory Bowel Disease and Colitis-Associated Cancer. Methods in Molecular Biology. 1725, 3-13 (2018).
- Jurjus, A. R., Khoury, N. N., Reimund, J. M. Animal models of inflammatory bowel disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (2), 81-92 (2004).
- Mizoguchi, A., Takeuchi, T., Himuro, H., Okada, T., Mizoguchi, E. Genetically engineered mouse models for studying inflammatory bowel disease. Journal of Pathology. 238 (2), 205-219 (2016).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (1), 256-261 (2009).
- Alam, A., et al. The microenvironment of injured murine gut elicits a local pro-restitutive microbiota. Nature Microbiology. 1, 15021 (2016).
- Alam, A., et al. Redox signaling regulates commensal-mediated mucosal homeostasis and restitution and requires formyl peptide receptor 1. Mucosal Immunology. 7 (3), 645-655 (2014).
- Kuhn, K. A., Manieri, N. A., Liu, T. C., Stappenbeck, T. S. IL-6 stimulates intestinal epithelial proliferation and repair after injury. PLoS One. 9 (12), 114195 (2014).
- Leoni, G., et al. Annexin A1, formyl peptide receptor, and NOX1 orchestrate epithelial repair. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 443-454 (2013).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139 (6), 1837-1843 (2010).
- Montrose, D. C., et al. Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice as a Useful Model for Evaluating the Roles of Host and Luminal Factors in Colonic Inflammation. American Journal of Pathology. 188 (12), 2811-2825 (2018).
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. Journal of Visualized Experiments. (90), (2014).
