마우스에서 대장 내 시경 유도 핀치 생검을 수행하고 후속 조직 변화를 평가
Summary
여기에서, 우리는 마우스에 있는 대장 내시경 유도핀치 생검을 유도하고 실시간으로 상처 폐쇄를 추적하는 절차에 대한 상세한 설명을 제공합니다. 또한, 상처 침대의 조직학적, 면역 조직 화학 및 분자 분석을 위한 조직의 제조를 위한 방법이 제공됩니다.
Abstract
급성 부상 반응뿐만 아니라 상처 치유 과정에서 발생하는 조직 및 세포 변화를 이해하는 것은 위장관 (GI) 관의 질병을 연구 할 때 가장 중요합니다. 뮤린 식민지 핀치 생검 모델은 이러한 프로세스를 정의하는 유용한 도구입니다. 추가적으로, 창자 발광 함량 (예를 들면, 세균) 및 결장 사이 상호 작용을 공부할 수 있습니다. 그러나, 상처 유도 및 신뢰할 수 있는 방식으로 시간이 지남에 따라 상처 폐쇄를 추적 하는 능력은 어려울 수 있습니다. 더욱이, 조직 제제 및 방향은 조직학적 및 분자 변화를 최적으로 심문하는 표준화된 방법으로 수행되어야 합니다. 여기서는 생검으로 인한 부상과 반복대장내시경 검사를 통한 상처 폐쇄 모니터링을 설명하는 상세한 방법을 제시합니다. 상처 크기의 일관되고 재현 가능한 측정, 분자 분석을 위해 상처 침대를 수집하고 조직의 단면에 상처 침대를 시각화할 수 있는 능력을 보장하는 접근법이 설명되어 있습니다. 성공적으로 이러한 기술을 수행 하는 능력은 급성 부상 응답의 연구에 대 한 수 있습니다., 상처 치유 와 결장 내에서 발 광 호스트 상호 작용.
Introduction
위장관(GI)은 여러 기능, 숙주 세포 유형(예: 상피, 면역, 기질 등)뿐만 아니라 수조 개의 미생물을 고려할 때 복잡한 장기 시스템입니다. 이 복잡성에 비추어, 기관의 질병은 수시로 이 요인의 전부의 상호 작용을 관련시킵니다. 예를 들어, 염증성 장질환(IBD)은 염증성 세포, 이영양증 및 상피수리1,2,3,4,5,6,7의활성화를 포함하는 기관내 염증 및 완화의 주기와 관련이 있다. IBD 및 기장의 그밖 선동적인 조건을 연구하기 위하여 적당한 모형 시스템을 갖는 것은 질병의 병인을 해명하기 위하여 중요합니다. 여러 가지 모델은 유전적으로 조작된 마우스를 포함한 IBD 병인증을 연구하고 설치류8,9,10에서황산나트륨(DSS)과 같은 화학 물질의 사용을 연구하기 위해 존재한다. 이 모형의 한계는 정확하게 상처 치유를 평가하는 어려움뿐만 아니라 염증의 유도를 통제하는 무능력을 포함합니다. IBD 병기의 양상을 모방하는 대체 방법은 치료법 개발에 유용할 수 있습니다.
마우스의 대장내시경 유도 핀치 생검은 염증 반응, 상처 치유, 결장의 숙주 미생물 상호 작용의 병기 발생을 연구하는 유용한 모델 시스템을 제공합니다. 이 접근법은 2009년에 실험 도구로 처음 사용되었으며, 이는 창자 11에서 급성 염증 반응 및 상처 치유를 연구하는 데 유용성을입증했습니다. 후속 연구는 대장 상처 치유11,12,13,14,15,16,17,18에서,대장 상처 치유에서, 장내 미생물뿐만 아니라 다른 신호 경로의 역할을 평가하기위해이기술을 활용. 최근에는 이 모델을 사용하여 대장 상해에 대한 급성 반응에서 스핑고신-1-인산염 신호 및 박테리아의 중요성을조사하였다. 유용하지만, 마우스에서 대장 내시경 유도 핀치 생검을 수행하고 후속 조직 변화를 평가하는 것은 기술적으로 어려울 수 있습니다. 예를 들어, 장의 천공은 부상유도시 발생할 수 있으며 연쇄 대장 내시경 검사를 통해 상처 침대의 일관된 측정을 보장하는 것은 어려울 수 있습니다. 또한, 조직학적 또는 면역 조직화학 분석을 위해 상처 침대를 제대로 시각화하기 위해 대장 조직을 올바르게 지향하는 것은 어려울 수 있다. 이러한방법(18,20)에관한 일부 정보가 존재하지만, 이러한 기술에 대한 정확한 단계별 설명은 시각적 보조장치가 이 모델의 신뢰성과 더 넓은 유용성을 향상시킵니다. 여기에서, 우리는 마우스에 있는 대장 내시경 유도 핀치 생검을 실행하고, 시간이 지남에 따라 상처 폐쇄를 추적하고 상처 침대의 조직학 및 분자 분석을 가능하게 하기 위하여 조직을 준비하는 상세한 방법을 제시합니다. 이러한 기술을 수행하는 표준 방법을 만드는 것은 GI 염증 및 상처 수리에 잠재적으로 중요한 이전에 조사되지 않은 중재자를 연구하기 위해이 모델의 사용을 확장 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 모델에서 상처 폐쇄 속도를 효과적으로 평가하려고 할 때 일관되고 정확한 생검과 상처 크기의 측정을 보장하는 것이 가장 중요합니다. 따라서 절차가 올바르게 수행되고 있음을 확신하기 위해 몇 가지 조치를 취해야 합니다. 첫째, 생검의 깊이가 너무 얕거나 깊어서는 안됩니다. 너무 얕으면 상처 닫기를 평가하기에 충분한 창이 없습니다. 그림 2는 0일째에 최적의 생검 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 크론과 대장염 재단(D.C.M)과 뉴욕 크론재단(D.C.M 및 A.J.D.의 보조금으로 지원되었습니다. 저자는 이 기사에 비디오 반주를 만드는 데 도움을 준 카르멘 페라라 양에게 감사드립니다.
Materials
| Biopsy forceps, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
| Coloview Tower system | Karl Storz | contact company | |
| Examination sheath, 9 Fr, Kit | Karl Storz | 61029DK | |
| Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
| isofluorane | Covetrus | 2905 | |
| methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| micro iris scissors | Integra | 18-1619 | |
| NIH ImageJ | NIH | N/A | software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Pawfly MA-60 aquarium pump | Amazon | N/A | |
| scalpal with #10 blade | Hill-Rom | 372610 |
References
- Boal Carvalho, P., Cotter, J. Mucosal Healing in Ulcerative Colitis: A Comprehensive Review. Drugs. 77 (2), 159-173 (2017).
- Chen, M. L., Sundrud, M. S. Cytokine Networks and T-Cell Subsets in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (5), 1157-1167 (2016).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Halfvarson, J., et al. Dynamics of the human gut microbiome in inflammatory bowel disease. Nature Microbiology. 2, 17004 (2017).
- Johansson, M. E., et al. Bacteria penetrate the normally impenetrable inner colon mucus layer in both murine colitis models and patients with ulcerative colitis. Gut. 63 (2), 281-291 (2014).
- Luissint, A. C., Parkos, C. A., Nusrat, A. Inflammation and the Intestinal Barrier: Leukocyte-Epithelial Cell Interactions, Cell Junction Remodeling, and Mucosal Repair. Gastroenterology. 151 (4), 616-632 (2016).
- Pineton de Chambrun, G., Blanc, G., Peyrin-Biroulet, L. Current evidence supporting mucosal healing and deep remission as important treatment goals for inflammatory bowel disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 10 (8), 915-927 (2016).
- Fung, K. Y., Putoczki, T. In Vivo Models of Inflammatory Bowel Disease and Colitis-Associated Cancer. Methods in Molecular Biology. 1725, 3-13 (2018).
- Jurjus, A. R., Khoury, N. N., Reimund, J. M. Animal models of inflammatory bowel disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (2), 81-92 (2004).
- Mizoguchi, A., Takeuchi, T., Himuro, H., Okada, T., Mizoguchi, E. Genetically engineered mouse models for studying inflammatory bowel disease. Journal of Pathology. 238 (2), 205-219 (2016).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (1), 256-261 (2009).
- Alam, A., et al. The microenvironment of injured murine gut elicits a local pro-restitutive microbiota. Nature Microbiology. 1, 15021 (2016).
- Alam, A., et al. Redox signaling regulates commensal-mediated mucosal homeostasis and restitution and requires formyl peptide receptor 1. Mucosal Immunology. 7 (3), 645-655 (2014).
- Kuhn, K. A., Manieri, N. A., Liu, T. C., Stappenbeck, T. S. IL-6 stimulates intestinal epithelial proliferation and repair after injury. PLoS One. 9 (12), 114195 (2014).
- Leoni, G., et al. Annexin A1, formyl peptide receptor, and NOX1 orchestrate epithelial repair. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 443-454 (2013).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139 (6), 1837-1843 (2010).
- Montrose, D. C., et al. Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice as a Useful Model for Evaluating the Roles of Host and Luminal Factors in Colonic Inflammation. American Journal of Pathology. 188 (12), 2811-2825 (2018).
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. Journal of Visualized Experiments. (90), (2014).
