Выполнение Колоноскопической-Guided Pinch биопсии у мышей и оценки последующих изменений тканей
Summary
Здесь мы предоставляем подробное описание процедуры, чтобы вызвать колоноскопические управляемые щепотку биопсии у мышей и отслеживать замыкание ран в режиме реального времени. Кроме того, предусмотрены методы подготовки тканей для гистологического, иммуногистохимического и молекулярного анализа раневого койки.
Abstract
Понимание тканей и клеточных изменений, которые происходят в острой реакции травмы, а также во время процесса заживления ран имеет первостепенное значение при изучении заболеваний желудочно-кишечного тракта (ГИ) тракта. Murine толстой кишки щепотку биопсии модель является полезным инструментом для определения этих процессов. Кроме того, можно изучить взаимодействие между содержанием люминесцентных опухолей кишечника (например, микробов) и толстой кишки. Тем не менее, индукция ран и способность отслеживать закрытие раны с течением времени надежным образом может быть сложной задачей. Кроме того, подготовка и ориентация тканей должны осуществляться стандартизированным способом оптимального допроса гистологических и молекулярных изменений. Здесь мы представляем подробный метод, описывающий биопсии индуцированной травмы и мониторинга закрытия раны с помощью повторных колоноскопии. Описан подход, который обеспечивает последовательные и воспроизводимые измерения размера раны, способность собирать раневую кровать для молекулярного анализа, а также визуализировать раневую кровать при разделе тканей. Способность успешно выполнять эти методы позволяет для изучения острой реакции травмы, заживление ран и светящиеся взаимодействия в толстой кишке.
Introduction
Желудочно-кишечный тракт (ГИ) является сложной системой органов, учитывая его многочисленные функции, типы клеток-хозяина (например, эпителиальные, иммунные, стромальные и т.д.), а также триллионы микробов. В свете этой сложности, заболевания желудочно-кишечного тракта часто связаны с взаимодействием всех этих факторов. Например, воспалительные заболевания кишечника (IBD) связаны с циклами воспаления и ремиссии в желудочно-кишечном тракте, с участием активации воспалительных клеток, дисбактериоза иэпителиального ремонта 1,2,3,4,5,6,7. Наличие соответствующих модельных систем для изучения IBD и других воспалительных состояний желудочно-кишечного тракта имеет решающее значение для выяснения патогенеза болезни. Существует несколько моделей для изучения патогенеза IBD, включая генетически модифицированных мышей и использование химических веществ, таких как декстран сульфат натрия (DSS)у грызунов 8,9,10. Ограничения этих моделей включают в себя неспособность точно контролировать индукцию воспаления, а также трудности в оценке заживления ран. Альтернативные методы для имитации аспектов патогенеза IBD может оказаться полезным для разработки методов лечения.
Колоноскопическая биопсия щепотки у мышей предлагает полезную модельную систему для изучения патогенеза воспалительной реакции, заживления ран, а также взаимодействия хост-микробов в толстой кишке. Этот подход был впервые использован в качестве экспериментального инструмента в 2009 году, который продемонстрировал свою полезность для изучения острой воспалительной реакции и заживления ран вкишечнике 11. Последующие исследования использовали эту технику для оценки роли различных сигнальных путей, а также микрофлоры кишечника, в заживлении толстой кишкираны 11,12,13,14,15,16,17,18. Совсем недавно, наша группа использовала эту модель для изучения важности сфингозина-1-фосфат сигнализации и бактерий в острой реакции на травмы толстойкишки 19. Хотя полезно, проведение колоноскопических управляемых щепотку биопсии у мышей и оценки последующих изменений тканей может быть технически сложной задачей. Например, перфорация кишечника может произойти при индукции травмы и обеспечения последовательных измерений раневого койко-поколя через серийные колоноскопии может быть трудно. Кроме того, ориентация толстой ткани должным образом визуализировать раневую кровать для гистологических или иммуногистохимических анализов может быть сложной задачей. Хотя некоторая информация существует в отношенииэтих методов 18,20, точное пошаговое описание этих методов вместе будет визуальные пособия обещает повысить надежность и более широкую полезность этой модели. Здесь мы представляем подробный метод проведения колоноскопической биопсии щепотки у мышей, отслеживания закрытия раны с течением времени и подготовить ткани, чтобы гистологические и молекулярные анализы раны кровать. Создание стандартного метода для выполнения этих методов может расширить использование этой модели для изучения ранее нерасследованных посредников, которые потенциально важны для воспаления Г.И. и восстановления ран.
Protocol
Representative Results
Discussion
Обеспечение последовательной и точной биопсии, а также измерения размера раны имеют первостепенное значение при попытке эффективно оценить скорость закрытия раны в этой модели. Поэтому необходимо принять ряд мер, чтобы быть уверенными в том, что процедуры выполняются правильно. Во-пе?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Фонда Крона и Колитиса (D.C.M) и Фонда Крона (D.C.M. и A.J.D.). Авторы благодарят г-жу Кармен Феррару за помощь в создании видео аккомпанемента к этой статье.
Materials
| Biopsy forceps, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
| Coloview Tower system | Karl Storz | contact company | |
| Examination sheath, 9 Fr, Kit | Karl Storz | 61029DK | |
| Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
| isofluorane | Covetrus | 2905 | |
| methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| micro iris scissors | Integra | 18-1619 | |
| NIH ImageJ | NIH | N/A | software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Pawfly MA-60 aquarium pump | Amazon | N/A | |
| scalpal with #10 blade | Hill-Rom | 372610 |
References
- Boal Carvalho, P., Cotter, J. Mucosal Healing in Ulcerative Colitis: A Comprehensive Review. Drugs. 77 (2), 159-173 (2017).
- Chen, M. L., Sundrud, M. S. Cytokine Networks and T-Cell Subsets in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (5), 1157-1167 (2016).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Halfvarson, J., et al. Dynamics of the human gut microbiome in inflammatory bowel disease. Nature Microbiology. 2, 17004 (2017).
- Johansson, M. E., et al. Bacteria penetrate the normally impenetrable inner colon mucus layer in both murine colitis models and patients with ulcerative colitis. Gut. 63 (2), 281-291 (2014).
- Luissint, A. C., Parkos, C. A., Nusrat, A. Inflammation and the Intestinal Barrier: Leukocyte-Epithelial Cell Interactions, Cell Junction Remodeling, and Mucosal Repair. Gastroenterology. 151 (4), 616-632 (2016).
- Pineton de Chambrun, G., Blanc, G., Peyrin-Biroulet, L. Current evidence supporting mucosal healing and deep remission as important treatment goals for inflammatory bowel disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 10 (8), 915-927 (2016).
- Fung, K. Y., Putoczki, T. In Vivo Models of Inflammatory Bowel Disease and Colitis-Associated Cancer. Methods in Molecular Biology. 1725, 3-13 (2018).
- Jurjus, A. R., Khoury, N. N., Reimund, J. M. Animal models of inflammatory bowel disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (2), 81-92 (2004).
- Mizoguchi, A., Takeuchi, T., Himuro, H., Okada, T., Mizoguchi, E. Genetically engineered mouse models for studying inflammatory bowel disease. Journal of Pathology. 238 (2), 205-219 (2016).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (1), 256-261 (2009).
- Alam, A., et al. The microenvironment of injured murine gut elicits a local pro-restitutive microbiota. Nature Microbiology. 1, 15021 (2016).
- Alam, A., et al. Redox signaling regulates commensal-mediated mucosal homeostasis and restitution and requires formyl peptide receptor 1. Mucosal Immunology. 7 (3), 645-655 (2014).
- Kuhn, K. A., Manieri, N. A., Liu, T. C., Stappenbeck, T. S. IL-6 stimulates intestinal epithelial proliferation and repair after injury. PLoS One. 9 (12), 114195 (2014).
- Leoni, G., et al. Annexin A1, formyl peptide receptor, and NOX1 orchestrate epithelial repair. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 443-454 (2013).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139 (6), 1837-1843 (2010).
- Montrose, D. C., et al. Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice as a Useful Model for Evaluating the Roles of Host and Luminal Factors in Colonic Inflammation. American Journal of Pathology. 188 (12), 2811-2825 (2018).
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. Journal of Visualized Experiments. (90), (2014).
