ביצוע ביופסיות צביטה קולונוסקופיות מונחות בעכברים והערכת שינויים ברקמות הבאים
Summary
כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של ההליך כדי לגרום ביופסיות צביטה מונחה קולונוסקופית בעכברים ולעקוב אחר סגירת פצע בזמן אמת. בנוסף, מסופקות שיטות להכנת רקמות לניתוחים היסטולוגיים, אימונוהיסטוכימיים ומולקולריים של מיטת הפצע.
Abstract
הבנת הרקמה והשינויים התאיים המתרחשים בתגובה לפציעה חריפה כמו גם במהלך תהליך ריפוי הפצע היא בעלת חשיבות עליונה בעת לימוד מחלות של מערכת העיכול (GI) בדרכי. מודל הביופסיה של קמצוץ המעי הגס מורין הוא כלי שימושי להגדרת תהליכים אלה. בנוסף, ניתן ללמוד את יחסי הגומלין בין תכולת המעיים הזוהר (למשל, מיקרובים) לבין המעי הגס. עם זאת, אינדוקציה פצע ואת היכולת לעקוב אחר סגירת פצע לאורך זמן באופן אמין יכול להיות מאתגר. יתר על כן, הכנת רקמות והתמצאות חייב להתבצע בצורה מתוקננת כדי לחקור בצורה אופטימלית שינויים היסטולוגיים ומולקולריים. כאן, אנו מציגים שיטה מפורטת המתארת פגיעה הנגרמת על ידי ביופסיה וניטור של סגירת פצעים באמצעות קולונוסקופיה חוזרת. מתוארת גישה המבטיחה מדידות עקביות וניתנות לשחזור של גודל הפצע, היכולת לאסוף את מיטת הפצע לניתוחים מולקולריים, כמו גם לדמיין את מיטת הפצע עם חתך של רקמות. היכולת לבצע בהצלחה טכניקות אלה מאפשרת מחקרים של תגובת פציעה חריפה, ריפוי פצעים ואינטראקציות מארח זוהר בתוך המעי הגס.
Introduction
מערכת העיכול (GI) היא מערכת איברים מורכבת בהתחשב בפונקציות המרובות שלה, סוגי תאים מארחים (למשל אפיתל, חיסוני, סטרומה וכו ‘) כמו גם טריליוני חיידקים. לאור מורכבות זו, מחלות של GI בדרכי לעתים קרובות לערב את יחסי הגומלין של כל הגורמים האלה. לדוגמה, מחלות מעי דלקתיות (IBD) קשורות למחזורים של דלקת והפוגה במערכת העיכול, הכוללת הפעלה של תאים דלקתיים, dysbiosis, ותיקון אפיתל1,2,3,4,5,6,7. לאחר מערכות מודל מתאים ללמוד מחלות מעי דלקתיות ומצבים דלקתיים אחרים של מערכת העיכול היא קריטית עבור הבהרות הפתוגנזה של המחלה. קיימים מספר מודלים לחקר פתוגנזה IBD כולל עכברים מהונדסים גנטית ושימוש בכימיקלים כגון דקסטרן נתרן גופרתי (DSS) במכרסמים8,9,10. מגבלות של מודלים אלה כוללות חוסר יכולת לשלוט במדויק על אינדוקציה של דלקת, כמו גם קשיים בהערכת ריפוי פצעים. שיטות חלופיות לחקות היבטים של פתוגנזה IBD יכול להוכיח שימושי לפיתוח טיפולים.
ביופסיות צביטה מונחות קולונוסקופיות בעכברים מציעות מערכת מודל שימושית לחקר הפתוגנזה של התגובה הדלקתית, ריפוי פצעים, כמו גם אינטראקציות מארח-חיידקים במעי הגס. גישה זו שימשה לראשונה ככלי ניסיוני בשנת 2009, אשר הדגים את התועלת שלה לחקר התגובה הדלקתית החריפה וריפוי פצעים במעיים11. מחקרים מאוחרים יותר השתמשו בטכניקה זו כדי להעריך את התפקידים של מסלולי איתות שונים, כמו גם את microbiota הבטן, בריפוי פצע המעי הגס11,12,13,14,15,16,17,18. לאחרונה, הקבוצה שלנו השתמשה במודל זה כדי לחקור את החשיבות של איתות sphingosine-1-פוספט וחיידקים בתגובה חריפה לפגיעה המעי הגס19. למרות שימושי, ביצוע ביופסיות צביטה מונחה קולונוסקופית בעכברים והערכת שינויים ברקמות הבאים יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית. לדוגמה, ניקוב המעי יכול להתרחש עם אינדוקציה של פציעה ולהבטיח מדידות עקביות של מיטת הפצע באמצעות קולונוסקופיה סדרתית יכול להיות קשה. בנוסף, התמצאות נכונה של רקמת המעי הגס כדי לדמיין את מיטת הפצע לניתוחים היסטולוגיים או אימונוהיסטוכימיים יכולה להיות מאתגרת. למרות שחלק מהמידע קיים לגבי שיטות אלה18,20, תיאור מדויק מבחינת צעדים של טכניקות אלה לאורך עזרים חזותיים מבטיח לשפר את האמינות ואת התועלת הרחבה יותר של מודל זה. כאן, אנו מציגים שיטה מפורטת לביצוע ביופסיות צביטה מונחות קולונוסקופיה בעכברים, לעקוב אחר סגירת פצעים לאורך זמן ולהכין את הרקמה כדי לאפשר ניתוחים היסטולוגיים ומולקולריים של מיטת הפצע. יצירת שיטה סטנדרטית לביצוע טכניקות אלה יכולה להרחיב את השימוש במודל זה כדי ללמוד מתווכים שלא נחקרו בעבר שעשויים להיות חשובים לדלקת GI ותיקון פצעים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הבטחת ביופסיות עקביות ומדויקות, כמו גם מדידות של גודל הפצע הם בעלי חשיבות עליונה בעת ניסיון להעריך ביעילות את קצב סגירת הפצע במודל זה. לכן, יש לנקוט מספר צעדים כדי להיות בטוחים כי ההליכים מתבצעים כראוי. ראשית, עומק הביופסיה לא חייב להיות רדוד מדי או עמוק מדי. אם רדוד מדי, לא יהיה חלון מספיק כ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרוהן וקרן קוליטיס (D.C.M) וקרן קרוהן של ניו יורק (D.C.M. ו- A.J.D.). המחברים מודים לגברת כרמן פרארה על הסיוע ביצירת הליווי של הוידאו למאמר זה.
Materials
| Biopsy forceps, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
| Coloview Tower system | Karl Storz | contact company | |
| Examination sheath, 9 Fr, Kit | Karl Storz | 61029DK | |
| Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
| isofluorane | Covetrus | 2905 | |
| methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| micro iris scissors | Integra | 18-1619 | |
| NIH ImageJ | NIH | N/A | software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Pawfly MA-60 aquarium pump | Amazon | N/A | |
| scalpal with #10 blade | Hill-Rom | 372610 |
References
- Boal Carvalho, P., Cotter, J. Mucosal Healing in Ulcerative Colitis: A Comprehensive Review. Drugs. 77 (2), 159-173 (2017).
- Chen, M. L., Sundrud, M. S. Cytokine Networks and T-Cell Subsets in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (5), 1157-1167 (2016).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Halfvarson, J., et al. Dynamics of the human gut microbiome in inflammatory bowel disease. Nature Microbiology. 2, 17004 (2017).
- Johansson, M. E., et al. Bacteria penetrate the normally impenetrable inner colon mucus layer in both murine colitis models and patients with ulcerative colitis. Gut. 63 (2), 281-291 (2014).
- Luissint, A. C., Parkos, C. A., Nusrat, A. Inflammation and the Intestinal Barrier: Leukocyte-Epithelial Cell Interactions, Cell Junction Remodeling, and Mucosal Repair. Gastroenterology. 151 (4), 616-632 (2016).
- Pineton de Chambrun, G., Blanc, G., Peyrin-Biroulet, L. Current evidence supporting mucosal healing and deep remission as important treatment goals for inflammatory bowel disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 10 (8), 915-927 (2016).
- Fung, K. Y., Putoczki, T. In Vivo Models of Inflammatory Bowel Disease and Colitis-Associated Cancer. Methods in Molecular Biology. 1725, 3-13 (2018).
- Jurjus, A. R., Khoury, N. N., Reimund, J. M. Animal models of inflammatory bowel disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (2), 81-92 (2004).
- Mizoguchi, A., Takeuchi, T., Himuro, H., Okada, T., Mizoguchi, E. Genetically engineered mouse models for studying inflammatory bowel disease. Journal of Pathology. 238 (2), 205-219 (2016).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (1), 256-261 (2009).
- Alam, A., et al. The microenvironment of injured murine gut elicits a local pro-restitutive microbiota. Nature Microbiology. 1, 15021 (2016).
- Alam, A., et al. Redox signaling regulates commensal-mediated mucosal homeostasis and restitution and requires formyl peptide receptor 1. Mucosal Immunology. 7 (3), 645-655 (2014).
- Kuhn, K. A., Manieri, N. A., Liu, T. C., Stappenbeck, T. S. IL-6 stimulates intestinal epithelial proliferation and repair after injury. PLoS One. 9 (12), 114195 (2014).
- Leoni, G., et al. Annexin A1, formyl peptide receptor, and NOX1 orchestrate epithelial repair. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 443-454 (2013).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139 (6), 1837-1843 (2010).
- Montrose, D. C., et al. Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice as a Useful Model for Evaluating the Roles of Host and Luminal Factors in Colonic Inflammation. American Journal of Pathology. 188 (12), 2811-2825 (2018).
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. Journal of Visualized Experiments. (90), (2014).
