Utføre kolonoskopisk-guidet klype biopsier i mus og evaluere påfølgende vevsendringer
Summary
Her gir vi en detaljert beskrivelse av prosedyren for å indusere kolonoskopisk-guidede klypebiopsier hos mus og spore sårlukking i sanntid. I tillegg er metoder for fremstilling av vev for histologiske, immunohistokjemiske og molekylære analyser av sårsengen gitt.
Abstract
Forstå vev og cellulære endringer som oppstår i akutt skaderespons så vel som under sårhelingsprosessen er av avgjørende betydning når du studerer sykdommer i mage-tarmkanalen (GI). Den murine kolonklep biopsimodellen er et nyttig verktøy for å definere disse prosessene. I tillegg kan samspillet mellom tarmarminnhold (f.eks. mikrober) og tykktarmen studeres. Imidlertid kan sårinduksjon og evnen til å spore sårlukking over tid på en pålitelig måte være utfordrende. Videre må vevsforberedelse og orientering utføres på en standardisert måte for å optimalt avhøre histologiske og molekylære endringer. Her presenterer vi en detaljert metode som beskriver biopsiindusert skade og overvåking av sårlukking gjennom gjentatte kolonoskopier. En tilnærming er beskrevet som sikrer konsistente og reproduserbare målinger av sårstørrelse, evnen til å samle sårsengen for molekylære analyser, samt visualisere sårsengen ved snitting av vev. Evnen til å utføre disse teknikkene gjør det mulig å studere akutt skaderespons, sårheling og luminalvertinteraksjoner i tykktarmen.
Introduction
Mage-tarmkanalen (GI) er et komplekst organsystem gitt flere funksjoner, vertscelletyper (f.eks. epitel, immun, stromal, etc.) samt billioner av mikrober. I lys av denne kompleksiteten involverer sykdommer i GI-kanalen ofte samspillet mellom alle disse faktorene. For eksempel er inflammatoriske tarmsykdommer (IBD) forbundet med sykluser av betennelse og remisjon i GI-kanalen, som involverer aktivering av inflammatoriske celler, dysbiose og epitelreparasjon1,2,3,4,5,6,7. Å ha passende modellsystemer for å studere IBD og andre inflammatoriske tilstander i GI-kanalen er avgjørende for å belyse patogenesen av sykdommen. Flere modeller finnes for å studere IBD patogenese inkludert genmodifiserte mus og bruk av kjemikalier som dextran natriumsulfat (DSS) hos gnagere8,9,10. Begrensninger av disse modellene inkluderer en manglende evne til å nøyaktig kontrollere induksjon av betennelse samt vanskeligheter med å evaluere sårheling. Alternative metoder for å etterligne aspekter av IBD patogenese kan være nyttige for å utvikle terapier.
Colonoskopisk-guidet klype biopsier hos mus tilbyr et nyttig modellsystem for å studere patogenesen av inflammatorisk respons, sårheling, samt vert-mikrobe interaksjoner i tykktarmen. Denne tilnærmingen ble først brukt som et eksperimentelt verktøy i 2009, som viste sitt verktøy for å studere akutt inflammatorisk respons og sårheling i tarmen11. Etterfølgende studier benyttet denne teknikken for å evaluere rollene til forskjellige signalveier samt tarmenmikrobiota, i kolonsårheling11,12,13,14,15,16,17,18. Mer nylig brukte vår gruppe denne modellen til å undersøke viktigheten av sphingosine-1-fosfat signalering og bakterier i akutt respons på colonic skade19. Selv om det er nyttig, kan det være teknisk utfordrende å utføre koloskopiskstyrte klypebiopsier hos mus og evaluere påfølgende vevsendringer. For eksempel kan perforering av tarmen oppstå ved induksjon av skade og sikre konsekvente målinger av sårsengen gjennom serielle kolonoskopier kan være vanskelig. I tillegg kan det være utfordrende å orientere det kolonvevet riktig for å visualisere sårsengen for histologiske eller immunohistokjemiske analyser. Selv om noe informasjon finnes om disse metodene18,20, en presis trinnvis beskrivelse av disse teknikkene sammen vil visuelle hjelpemidler lover å forbedre påliteligheten og bredere nytten av denne modellen. Her presenterer vi en detaljert metode for å utføre kolonoskopisk-guidede klypebiopsier hos mus, spore sårlukking over tid og forberede vevet for å muliggjøre histologiske og molekylære analyser av sårsengen. Opprette en standard metode for å utføre disse teknikkene kan utvide bruken av denne modellen for å studere tidligere uutførte meklere som er potensielt viktig for GI betennelse og sår reparasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Å sikre konsekvente og nøyaktige biopsier samt målinger av sårstørrelse er av avgjørende betydning når man forsøker å effektivt evaluere frekvensen av sårlukking i denne modellen. Derfor bør det tas flere tiltak for å være sikre på at prosedyrene utføres riktig. For det første må dybden av biopsien ikke være for grunn eller dyp. Hvis det er for grunt, vil det ikke være et tilstrekkelig vindu for å evaluere sårlukking. Figur 2 viser en optimal biopsidybde og -størrelse p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Crohns og Kolitt Foundation (D.C.M) og New York Crohn’s Foundation (D.C.M. og A.J.D.). Forfatterne takker Ms. Carmen Ferrara for hjelp til å lage videoakkompagnementet til denne artikkelen.
Materials
| Biopsy forceps, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
| Coloview Tower system | Karl Storz | contact company | |
| Examination sheath, 9 Fr, Kit | Karl Storz | 61029DK | |
| Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
| isofluorane | Covetrus | 2905 | |
| methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| micro iris scissors | Integra | 18-1619 | |
| NIH ImageJ | NIH | N/A | software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Pawfly MA-60 aquarium pump | Amazon | N/A | |
| scalpal with #10 blade | Hill-Rom | 372610 |
References
- Boal Carvalho, P., Cotter, J. Mucosal Healing in Ulcerative Colitis: A Comprehensive Review. Drugs. 77 (2), 159-173 (2017).
- Chen, M. L., Sundrud, M. S. Cytokine Networks and T-Cell Subsets in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (5), 1157-1167 (2016).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Halfvarson, J., et al. Dynamics of the human gut microbiome in inflammatory bowel disease. Nature Microbiology. 2, 17004 (2017).
- Johansson, M. E., et al. Bacteria penetrate the normally impenetrable inner colon mucus layer in both murine colitis models and patients with ulcerative colitis. Gut. 63 (2), 281-291 (2014).
- Luissint, A. C., Parkos, C. A., Nusrat, A. Inflammation and the Intestinal Barrier: Leukocyte-Epithelial Cell Interactions, Cell Junction Remodeling, and Mucosal Repair. Gastroenterology. 151 (4), 616-632 (2016).
- Pineton de Chambrun, G., Blanc, G., Peyrin-Biroulet, L. Current evidence supporting mucosal healing and deep remission as important treatment goals for inflammatory bowel disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 10 (8), 915-927 (2016).
- Fung, K. Y., Putoczki, T. In Vivo Models of Inflammatory Bowel Disease and Colitis-Associated Cancer. Methods in Molecular Biology. 1725, 3-13 (2018).
- Jurjus, A. R., Khoury, N. N., Reimund, J. M. Animal models of inflammatory bowel disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (2), 81-92 (2004).
- Mizoguchi, A., Takeuchi, T., Himuro, H., Okada, T., Mizoguchi, E. Genetically engineered mouse models for studying inflammatory bowel disease. Journal of Pathology. 238 (2), 205-219 (2016).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (1), 256-261 (2009).
- Alam, A., et al. The microenvironment of injured murine gut elicits a local pro-restitutive microbiota. Nature Microbiology. 1, 15021 (2016).
- Alam, A., et al. Redox signaling regulates commensal-mediated mucosal homeostasis and restitution and requires formyl peptide receptor 1. Mucosal Immunology. 7 (3), 645-655 (2014).
- Kuhn, K. A., Manieri, N. A., Liu, T. C., Stappenbeck, T. S. IL-6 stimulates intestinal epithelial proliferation and repair after injury. PLoS One. 9 (12), 114195 (2014).
- Leoni, G., et al. Annexin A1, formyl peptide receptor, and NOX1 orchestrate epithelial repair. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 443-454 (2013).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139 (6), 1837-1843 (2010).
- Montrose, D. C., et al. Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice as a Useful Model for Evaluating the Roles of Host and Luminal Factors in Colonic Inflammation. American Journal of Pathology. 188 (12), 2811-2825 (2018).
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. Journal of Visualized Experiments. (90), (2014).
