Impedantie pneumografie voor minimaal invasieve meting van hartslag in late fase ongewervelde dieren
Summary
Het meten van de hartslag tijdens een thermische uitdaging geeft inzicht in fysiologische reacties van organismen als gevolg van acute veranderingen in het milieu. Met behulp van de Amerikaanse kreeft (Homarus americanus) als een model organisme, dit protocol beschrijft het gebruik van impedantie pneumografie als een relatief niet-invasieve en niet-dodelijke aanpak om de hartslag te meten in het laat stadium ongewervelde dieren.
Abstract
De temperatuur in oceanen neemt snel toe als gevolg van wijdverspreide veranderingen in het wereldklimaat. Aangezien de fysiologie van organismen sterk wordt beïnvloed door de omgevingstemperatuur, heeft dit het potentieel om de thermische fysiologische prestaties in een verscheidenheid van mariene organismen te veranderen. Met behulp van de Amerikaanse kreeft (Homarus americanus) als een model organisme, dit protocol beschrijft het gebruik van impedantie pneumografie om te begrijpen hoe cardiale prestaties in de late fase ongewervelde dieren verandert onder acute thermische stress. Het protocol presenteert een minimaal invasieve techniek die het mogelijk maakt voor real-time verzameling van de hartslag tijdens een temperatuur ramping experiment. Gegevens kunnen gemakkelijk worden gemanipuleerd om een Arrhenius-plot te genereren dat wordt gebruikt om de breuktemperatuur van Arrhenius (ABT) te berekenen, de temperatuur waarmee de hartslag begint te dalen met stijgende temperaturen. Deze techniek kan worden gebruikt in een verscheidenheid van late fase ongewervelde dieren (dat wil zeggen, krabben, mosselen, of garnalen). Hoewel het protocol zich uitsluitend richt op de impact van temperatuur op de cardiale prestaties, kan het worden gewijzigd om het potentieel te begrijpen voor extra stressoren (bijvoorbeeld hypoxie of hypercapnie) om te interageren met temperatuur om fysiologische prestaties te beïnvloeden. Zo heeft de methode mogelijkheden voor uitgebreide toepassingen om verder te begrijpen hoe ongewervelde zeedieren reageren op acute veranderingen in de omgeving.
Introduction
In de afgelopen decennia heeft een verhoogde invoer van broeikasgassen (d.w.z. kooldioxide, methaan en lachgas) in de atmosfeer geleid tot wijdverbreide patronen van milieuverandering1. De oceanen van de wereld zijn snel opwarmen2,3, een trend die ernstige gevolgen kan hebben voor de fysiologie van organismen. Temperatuur beïnvloedt de fysiologische tarieven sterk en organismen hebben een optimaal temperatuurbereik voor prestaties4,5,6. Als zodanig kunnen individuen problemen ondervinden bij het handhaven van een goede zuurstoftoevoer naar weefsels, omdat de temperaturen buiten dit bereik afdwalen. Dit heeft het potentieel om te leiden tot dalingen van de aërobe prestaties in het gezicht van de opwarming van de oceaan temperaturen5,7.
In een laboratoriumomgeving is een methode om de fysiologische effecten van milieuverandering te begrijpen het onderzoeken van cardiale prestaties in de context van thermische stress. Dit geeft inzicht in hoe blootstelling aan voorspelde opwarmingscondities prestatiecurven5,6 en het potentieel voor acclimatisatieplasticiteit8kan veranderen. Een verscheidenheid van methoden zijn met succes geïmplementeerd om eerder te meten hartslag in mariene ongewervelde dieren. Echter, veel van deze technieken te betrekken chirurgische verwijdering of grote manipulatie van het exoskelet en langdurige implantatie van meetapparatuur9,10,11, die extra stress introduceert aan de proefpersoon en verhoogt de tijd die nodig is voor een succesvol herstel voorafgaand aan experimenten. Bovendien kunnen minder invasieve technieken (bijvoorbeeld visuele observatie, videografie) worden beperkt tot vroege levensgeschiedenisstadia wanneer organismen volledig of semi-transparant kunnen zijn12. Bovendien kunnen aanvullende uitdagingen worden voorgelegd aan onderzoekers die niet goed thuis zijn in meer technologisch geavanceerde methodologieën (bijvoorbeeld waarnemingen via infraroodtransducers of Doppler perfusie8,11).
Dit protocol maakt gebruik van de Amerikaanse kreeft (Homarus americanus) als een laat stadium mariene ongewervelde model om het gebruik van impedantie pneumografie aan te tonen voor de beoordeling van veranderingen in de hartslag tijdens een temperatuur ramping experiment. Impedantie pneumografie omvat het passeren van een oscillerende elektrische stroom (AC) over twee elektroden geplaatst aan weerszijden van het hartzakje om veranderingen in spanning te meten als het hart contracten en ontspant13,14. Deze techniek is minimaal invasief, omdat het gebruik maakt van kleine elektroden (d.w.z. 0,10-0,12 mm diameter) die voorzichtig worden geïmplanteerd net onder het exoskelet. Ten slotte biedt het real-time beoordelingen van zowel de hartslag als de watertemperatuur tijdens de oprit door het gebruik van een datalogger.
Het protocol bevat ook instructies voor het berekenen van Arrhenius breuktemperatuur (ABT), de temperatuur waarmee de hartslag begint te dalen met stijgende temperaturen13,15. De ABT dient als een niet-dodelijke indicator van de thermische limiet van de capaciteit in proefpersonen die kunnen worden begunstigd boven het meten van de kritische thermische maximum (CTmax, de bovengrens van cardiale functie5,6), zoals dodelijke grenzen zijn vaak extreem en zelden aangetroffen in de natuurlijke omgeving5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft het gebruik van impedantiepneumografie om veranderingen in de hartslag van late fase ongewervelde dieren te meten tijdens een temperatuur ramping experiment. Het belangrijkste voordeel van deze techniek in vergelijking met andere laboratoriumgebaseerde benaderingen9,10,11 is dat het minimaal invasief is en geen grote chirurgische manipulatie van het exoskelet inhoudt, waardoor de hoeveelheid hersteltijd d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Paul Rawson voor laboratoriumbijstand en de National Science Foundation award IIA-1355457 aan Maine EPSCoR aan de Universiteit van Maine voor fondsen om apparatuur te kopen. Dit project werd ondersteund door het USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch projectnummer MEO-21811 via het Maine Agricultural and Forest Experiment Station, evenals NOAA National Marine Fisheries Service Saltonstall Kennedy Grant #18GAR039-136. De auteurs bedanken ook drie anonieme recensenten voor hun opmerkingen over een eerdere versie van dit manuscript. Maine Landbouw en Forest Experiment Station Publicatie Nummer 3733.
Materials
| 1.6 mm (1/16 in) drill bit | Milwaukee Tool at Home Depot | 1001294900 | This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores. |
| 38 AWG Copper Magnet Wire | TEMCo | MW0093 | This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes. |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 852882 | This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace. |
| Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade | Fisher BioReagents | BP82931GAL | This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Excel | Microsoft | N/A | This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems. |
| Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit | Fisher Scientific | 08-855 | This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol. |
| Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz | Fisher Scientific | 13-874-180 | This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use. |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK | Grainger | 5WHE6 | Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors. |
| Impedance converter | UFI | Model 2991 | Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three. |
| LabChart software | ADInstruments | N/A | Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes. |
| LED Soldering Iron | Grainger | 28EA35 | This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes. |
| PowerLab datalogger | ADInstruments | ML826 | There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel. |
| Prism8 | GraphPad | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems. |
| R | R Project | N/A | This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website. |
| Rosin Core Solder | Grainger | 331856 | This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes). |
| SAS | SAS Institute | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems. |
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | N/A | This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers. |
| T-type Pod | ADInstruments | ML312 | Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples. |
| T-type Thermocouple Probe | ADInstruments | MLT1401 | Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m. |
| UV Cable Tie, Black | Home Depot | 295813 | This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store. |
References
- Stocker, T. F., et al. . Climate Change 2013: The Physical Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , (2013).
- Pershing, A. J., et al. Slow adaptation in the face of rapid warming leads to collapse of the Gulf of Maine cod fishery. Science. 350 (6262), 809-812 (2015).
- Smale, D. A., et al. Marine heat waves threaten global biodiversity and the provision of ecosystem services. Nature Climate Change. 9 (4), 306-316 (2019).
- Pörtner, H. O., Farrell, A. P. Physiology and climate change. Science. 322 (5902), 690-692 (2008).
- Pörtner, H. O., Bock, C., Mark, F. C. Oxygen- and capacity-limited thermal tolerance: bridging ecology and physiology. Journal of Experimental Biology. 220 (15), 2685-2696 (2017).
- Somero, G. N., Lockwood, B. L., Tomanek, L. . Biochemical adaptation: response to environmental challenges, from life’s origins to the Anthropocene. , (2017).
- Sokolova, I. M., Frederich, M., Bagwe, R., Lanning, G., Sukhotin, A. A. Energy homeostasis as an integrative tool for assessing limits of environmental stress tolerance in aquatic invertebrates. Marine Environmental Research. 79, 1-15 (2012).
- Tepolt, C. K., Somero, G. N. Master of all trades: thermal acclimation and adaptation of cardiac function in a broadly distributed marine invasive species, the European green crab, Carcinus maenas. Journal of Experimental Biology. 217 (7), 1129-1138 (2014).
- Frederich, M., Pörtner, H. O. Oxygen limitation of thermal tolerance defined by cardiac and ventilatory performance in spider crab, Maja squinado. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 279 (5), 1531-1538 (2000).
- Metzger, R., Sartoris, F. J., Langenbuch, M., Pörtner, H. O. Influence of elevated CO2 concentrations on thermal tolerance of the edible crab Cancer pagurus. Journal of Thermal Biology. 32, 144-151 (2007).
- Walther, K., Sartoris, F. J., Bock, C., Pörtner, H. O. Impact of anthropogenic ocean acidification on thermal tolerance of the spider crab Hyas araneus. Biogeosciences. 6 (10), 2207-2215 (2009).
- Styf, H. K., Sköld, H. N., Eriksson, S. P. Embryonic response to long-term exposure of the marine crustacean Nephrops norvegicus to ocean acidification. Ecology and Evolution. 3 (15), 5055-5065 (2013).
- Camacho, J., Qadri, S. A., Wang, H., Worden, M. K. Temperature acclimation alters cardiac performance in the lobster Homarus americanus. Journal of Comparative Physiology A. 192 (12), 1327-1334 (2006).
- Braby, C., Somero, G. N. Ecological gradients and relative abundance of native (Mytilus trossulus) and invasive (Mytilus galloprovincialis) blue mussels in the California hybrid zone. Marine Biology. 148 (6), 1249-1262 (2006).
- Stenseng, E., Braby, C. E., Somero, G. N. Evolutionary and acclimation-induced variation in the thermal limits of heart function in congeneric marine snails (Genus Tegula): implications for vertical zonation. Biological Bulletin. 208 (2), 138-144 (2005).
- Factor, J. . Biology of the Lobster: Homarus americanus. , (1995).
- Muggeo, V. M. Segmented: an R package to fit regression models with broken-lin relationships. R News. 8 (1), 20-25 (2008).
- Ryan, S. E., Porth, L. S. A tutorial on the piecewise regression approach applied to bedload transport data. General Technical Report RMS-GTR-189. , (2007).
- . . Prism8 Statistics Guide. , (2020).
- Cuculescu, M., Hyde, D., Bowler, K. Thermal tolerance of two species of marine crab, Cancer pagurus and Carcinus maenas. Journal of Thermal Biology. 23 (2), 107-110 (1998).
- Stillman, J. H. A comparative analysis of plasticity of thermal limits in porcelain crabs across latitudinal and intertidal zone clines. International Congress Series. 1275, 267-274 (2004).
- Maderia, D., et al. cellular and biochemical thermal stress response of intertidal shrimps with different vertical distributions: Palaemon elegans and Palaemon serratus. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A. 183, 107-115 (2015).
- Padilla-Ramirez, S., et al. The effects of thermal acclimation on the behavior, thermal tolerance, and respiratory metabolism in a crab inhabiting a wide range of thermal habitats (Cancer antennarius Stimpson, 1856, the red shore crab). Marine and Freshwater Behaviour and Physiology. 48 (2), 89-101 (2017).
- Pörtner, H. O. Ecosystem effects of ocean acidification in times of ocean warming: a physiologist’s view. Marine Ecology Progress Series. 373, 203-217 (2008).
- Pörtner, H. O. Oxygen- and capacity-limitation of thermal tolerance: a matrix for integrating climate-related stressor effects in marine ecosystems. Journal of Experimental Biology. 213 (6), 881-893 (2010).
- Zittier, Z. M. C., Hirse, T., Pörtner, H. O. The synergistic effects of increasing temperature and CO2 levels on activity capacity and acid-base balance in the spider crab, Hyas araneus. Marine Biology. 160 (8), 2049-2062 (2013).
- Harrington, A. M., Hamlin, H. J. Ocean acidification alters thermal cardiac performance, hemocyte abundance, and hemolymph chemistry in subadult American lobsters Homarus americanus H. Milne Edwards, 1837 (Decapoda: Malcostraca: Nephropidae). Journal of Crustacean Biology. 39 (4), 468-476 (2019).
- Depledge, M. H. Photoplethysmography – a non-invasive technique for monitoring heart beat and ventilation rate in decapod crustaceans. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 77 (2), 369-371 (1984).
