אימפאוגרפיה עכבה עבור מדידה פולשנית מינימלית של קצב הלב בשלב מאוחר יצורים חסרי חוליות
Summary
קצב לב מדידת במהלך אתגר תרמי מספק תובנה לתגובות פיסיולוגיים של אורגניזמים כתוצאה של שינוי סביבתי אקוטי. באמצעות הלובסטר האמריקאי (הומארוס אמריקאנוס) כאורגניזם מודל, פרוטוקול זה מתאר את השימוש האימפאוגרפיה עכבה כגישה בלתי פולשנית ולא קטלנית כדי למדוד את קצב הלב של חסרי חוליות בשלב מאוחר.
Abstract
הטמפרטורות באוקיינוסים הולכות וגדלות במהירות כתוצאה משינויים נרחבים באקלים העולמי. כאשר הפיזיולוגיה של הארגון מושפע במידה רבה מטמפרטורת הסביבה, זה בעל פוטנציאל לשנות ביצועים פיזיולוגיים תרמית במגוון של אורגניזמים ימיים. באמצעות לובסטר אמריקאי (הומארוס אמריקאנוס) כאורגניזם מודל, פרוטוקול זה מתאר את השימוש של האימפאוגרפיה עכבה כדי להבין כיצד ביצועים קרדיומטרים בשלב מאוחר משתנה תחת לחץ תרמי חריף. הפרוטוקול מציג טכניקה מינימלית פולשנית המאפשרת איסוף בזמן אמת של קצב הלב במהלך ניסוי הרפינג בטמפרטורה. נתונים מניפולציות בקלות כדי ליצור מזימה Arrhenius המשמש לחישוב הטמפרטורה של Arrhenius (ב), הטמפרטורה שבה קצב הלב מתחיל לרדת עם הגדלת טמפרטורות. ניתן להשתמש בטכניקה זו במגוון של יצורים חסרי חוליות בשלב מאוחר (כלומר, סרטנים, מולים או שרימפס). למרות שהפרוטוקול מתמקד אך ורק בהשפעה של הטמפרטורה על ביצועי הלב, ניתן לשנות אותו כדי להבין את הפוטנציאל של לחצים נוספים (למשל, היפוקסיה או hypercapnia) לקיים אינטראקציה עם הטמפרטורה כדי להשפיע על הביצועים הפיזיולוגיים. לפיכך, לשיטה יש פוטנציאל ליישומים רחבים כדי להבין עוד כיצד חסרי חוליות ימיים מגיבים לשינויים חריפים בסביבה.
Introduction
בעשורים האחרונים, מוגבר קלט גזי החממה (כלומר, פחמן דו חמצני, מתאן, ו תחמוצת החנקן) לתוך האטמוספירה הביא דפוסים נרחבים של שינוי סביבתי1. האוקיינוסים של העולם הם התחממות במהירות2,3, מגמה כי ייתכן השפעות חמורות על הפיזיולוגיה של אורגאימאל. הטמפרטורה משפיעה בכבדות על שיעורי פיסיולוגיים, ולאורגניזמים יש טווח טמפרטורות אופטימלי לביצועים4,5,6. ככאלה, אנשים עלולים להיתקל בקשיים בשמירה על אספקת חמצן נכונה לרקמות כאשר הטמפרטורות תועות מחוץ לטווח זה. לדבר זה יש פוטנציאל להוביל לירידות בביצועי אירובי בפני הטמפרטורות המתחממות של האוקיינוס5,7.
במסגרת מעבדה, שיטה להבנת ההשפעות הפיזיולוגיות של שינוי סביבתי היא לבחון את ביצועי הלב בהקשר של מתח תרמי. הדבר מספק תובנה כיצד חשיפה לתנאי ההתחממות החזוי עשויה לשנות את עקומות הביצועים5,6 , כמו גם את הפוטנציאל ליכולת הסתגלות הפלסטיות8. מגוון שיטות יושמו בהצלחה כדי למדוד את קצב הלב בפני חסרי חוליות ימיים. עם זאת, רבים של טכניקות אלה כרוכות הסרה כירורגית או טיפול מרכזי של שלד חיצוני והשרשה ממושכת של התקני מדידה9,10,11, אשר מציג מתח נוסף לנושא הבדיקה ומגביר את הזמן הדרוש להתאוששות מוצלחת לפני ניסויים. יתר על כן, טכניקות פחות פולשנית (למשל, התבוננות חזותית, videography) ניתן להגביל את השלבים המוקדמים בהיסטוריה של החיים כאשר אורגניזמים עשויים להיות מלא או שקוף למחצה12. יתרה מזאת, ניתן להציג אתגרים נוספים לחוקרים שאינם מקיאים בשיטות מתקדמות יותר מבחינה טכנולוגית (למשל, תצפיות באמצעות התמרה אינפרא-אדום או מיזוג דופלר8,11).
פרוטוקול זה משתמש הלובסטר האמריקאי (הומארוס אמריקאנוס) כמו מודל חסרי חוליות ימית בשלב מאוחר כדי להדגים את השימוש של האימפגרפיה עכבה להערכת שינויים בקצב הלב במהלך ניסוי הפינג טמפרטורה. הדיאוגרפיה עכבה מערבת מעבר של זרם חשמלי מנדנוד (AC) על פני שתי אלקטרודות הממוקמות משני צדי קרום הלב כדי למדוד שינויים במתח כחוזי הלב ומרגיעה13,14. טכניקה זו היא פולשנית מינימלית, כפי שהיא מעסיקה את השימוש באלקטרודות קטנות (כלומר, 0.10 – 0.12 מ”מ קוטר) כי הם מושתלים בעדינות רק מתחת לשלד החיצוני. לבסוף, הוא מספק הערכות בזמן אמת של קצב הלב וטמפרטורת המים במהלך הרמפה באמצעות לוגר נתונים.
הפרוטוקול מספק גם הוראות לחישוב טמפרטורת השבר arrhenius (ב), הטמפרטורה שבה קצב הלב מתחיל להצטמצם עם הגדלת טמפרטורות13,15. ה-t משמש כאינדיקציה לא קטלנית למגבלה התרמית של הקיבולת בנבדקים שעשויים להיות מועדפים על מדידת המקסימום התרמי הקריטי (CTmax, הגבול העליון של תפקוד הלב5,6), כמגבלות קטלניות הם לעתים קרובות קיצוניים ולעיתים רחוקות נתקלים בסביבה הטבעית5.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את השימוש ב העכבה הפנגרפיה כדי למדוד שינויים בקצב הלב של חסרי חוליות בשלב מאוחר במהלך ניסוי הרמפינג בטמפרטורה. היתרון העיקרי של טכניקה זו בהשוואה לגישות אחרות המבוססות על מעבדה9,10,11 הוא שזה פולשני מינימלית ולא כרוך מניפו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לפול רוליסון לסיוע במעבדה ופרס קרן המדע הלאומי IIA-1355457 למיין EPSCoR באוניברסיטת מיין עבור כספים כדי לרכוש ציוד. פרויקט זה היה נתמך על ידי המכון הלאומי של משרד החקלאות של המזון והחקלאות, מספר הפרויקט האטץ ‘-21811 באמצעות תחנת החקלאות והיער של מיין, כמו גם NOAA הלאומית הימית שירות הדיג Saltonstall קנדי גרנט #18GAR039-136. המחברים גם מודים לשלושה סוקרים אנונימיים על הערותיהם בגירסה קודמת של כתב היד. . הפרסום של תחנת היער והחקלאות מיין 3733
Materials
| 1.6 mm (1/16 in) drill bit | Milwaukee Tool at Home Depot | 1001294900 | This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores. |
| 38 AWG Copper Magnet Wire | TEMCo | MW0093 | This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes. |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 852882 | This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace. |
| Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade | Fisher BioReagents | BP82931GAL | This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Excel | Microsoft | N/A | This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems. |
| Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit | Fisher Scientific | 08-855 | This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol. |
| Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz | Fisher Scientific | 13-874-180 | This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use. |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK | Grainger | 5WHE6 | Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors. |
| Impedance converter | UFI | Model 2991 | Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three. |
| LabChart software | ADInstruments | N/A | Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes. |
| LED Soldering Iron | Grainger | 28EA35 | This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes. |
| PowerLab datalogger | ADInstruments | ML826 | There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel. |
| Prism8 | GraphPad | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems. |
| R | R Project | N/A | This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website. |
| Rosin Core Solder | Grainger | 331856 | This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes). |
| SAS | SAS Institute | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems. |
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | N/A | This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers. |
| T-type Pod | ADInstruments | ML312 | Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples. |
| T-type Thermocouple Probe | ADInstruments | MLT1401 | Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m. |
| UV Cable Tie, Black | Home Depot | 295813 | This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store. |
References
- Stocker, T. F., et al. . Climate Change 2013: The Physical Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , (2013).
- Pershing, A. J., et al. Slow adaptation in the face of rapid warming leads to collapse of the Gulf of Maine cod fishery. Science. 350 (6262), 809-812 (2015).
- Smale, D. A., et al. Marine heat waves threaten global biodiversity and the provision of ecosystem services. Nature Climate Change. 9 (4), 306-316 (2019).
- Pörtner, H. O., Farrell, A. P. Physiology and climate change. Science. 322 (5902), 690-692 (2008).
- Pörtner, H. O., Bock, C., Mark, F. C. Oxygen- and capacity-limited thermal tolerance: bridging ecology and physiology. Journal of Experimental Biology. 220 (15), 2685-2696 (2017).
- Somero, G. N., Lockwood, B. L., Tomanek, L. . Biochemical adaptation: response to environmental challenges, from life’s origins to the Anthropocene. , (2017).
- Sokolova, I. M., Frederich, M., Bagwe, R., Lanning, G., Sukhotin, A. A. Energy homeostasis as an integrative tool for assessing limits of environmental stress tolerance in aquatic invertebrates. Marine Environmental Research. 79, 1-15 (2012).
- Tepolt, C. K., Somero, G. N. Master of all trades: thermal acclimation and adaptation of cardiac function in a broadly distributed marine invasive species, the European green crab, Carcinus maenas. Journal of Experimental Biology. 217 (7), 1129-1138 (2014).
- Frederich, M., Pörtner, H. O. Oxygen limitation of thermal tolerance defined by cardiac and ventilatory performance in spider crab, Maja squinado. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 279 (5), 1531-1538 (2000).
- Metzger, R., Sartoris, F. J., Langenbuch, M., Pörtner, H. O. Influence of elevated CO2 concentrations on thermal tolerance of the edible crab Cancer pagurus. Journal of Thermal Biology. 32, 144-151 (2007).
- Walther, K., Sartoris, F. J., Bock, C., Pörtner, H. O. Impact of anthropogenic ocean acidification on thermal tolerance of the spider crab Hyas araneus. Biogeosciences. 6 (10), 2207-2215 (2009).
- Styf, H. K., Sköld, H. N., Eriksson, S. P. Embryonic response to long-term exposure of the marine crustacean Nephrops norvegicus to ocean acidification. Ecology and Evolution. 3 (15), 5055-5065 (2013).
- Camacho, J., Qadri, S. A., Wang, H., Worden, M. K. Temperature acclimation alters cardiac performance in the lobster Homarus americanus. Journal of Comparative Physiology A. 192 (12), 1327-1334 (2006).
- Braby, C., Somero, G. N. Ecological gradients and relative abundance of native (Mytilus trossulus) and invasive (Mytilus galloprovincialis) blue mussels in the California hybrid zone. Marine Biology. 148 (6), 1249-1262 (2006).
- Stenseng, E., Braby, C. E., Somero, G. N. Evolutionary and acclimation-induced variation in the thermal limits of heart function in congeneric marine snails (Genus Tegula): implications for vertical zonation. Biological Bulletin. 208 (2), 138-144 (2005).
- Factor, J. . Biology of the Lobster: Homarus americanus. , (1995).
- Muggeo, V. M. Segmented: an R package to fit regression models with broken-lin relationships. R News. 8 (1), 20-25 (2008).
- Ryan, S. E., Porth, L. S. A tutorial on the piecewise regression approach applied to bedload transport data. General Technical Report RMS-GTR-189. , (2007).
- . . Prism8 Statistics Guide. , (2020).
- Cuculescu, M., Hyde, D., Bowler, K. Thermal tolerance of two species of marine crab, Cancer pagurus and Carcinus maenas. Journal of Thermal Biology. 23 (2), 107-110 (1998).
- Stillman, J. H. A comparative analysis of plasticity of thermal limits in porcelain crabs across latitudinal and intertidal zone clines. International Congress Series. 1275, 267-274 (2004).
- Maderia, D., et al. cellular and biochemical thermal stress response of intertidal shrimps with different vertical distributions: Palaemon elegans and Palaemon serratus. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A. 183, 107-115 (2015).
- Padilla-Ramirez, S., et al. The effects of thermal acclimation on the behavior, thermal tolerance, and respiratory metabolism in a crab inhabiting a wide range of thermal habitats (Cancer antennarius Stimpson, 1856, the red shore crab). Marine and Freshwater Behaviour and Physiology. 48 (2), 89-101 (2017).
- Pörtner, H. O. Ecosystem effects of ocean acidification in times of ocean warming: a physiologist’s view. Marine Ecology Progress Series. 373, 203-217 (2008).
- Pörtner, H. O. Oxygen- and capacity-limitation of thermal tolerance: a matrix for integrating climate-related stressor effects in marine ecosystems. Journal of Experimental Biology. 213 (6), 881-893 (2010).
- Zittier, Z. M. C., Hirse, T., Pörtner, H. O. The synergistic effects of increasing temperature and CO2 levels on activity capacity and acid-base balance in the spider crab, Hyas araneus. Marine Biology. 160 (8), 2049-2062 (2013).
- Harrington, A. M., Hamlin, H. J. Ocean acidification alters thermal cardiac performance, hemocyte abundance, and hemolymph chemistry in subadult American lobsters Homarus americanus H. Milne Edwards, 1837 (Decapoda: Malcostraca: Nephropidae). Journal of Crustacean Biology. 39 (4), 468-476 (2019).
- Depledge, M. H. Photoplethysmography – a non-invasive technique for monitoring heart beat and ventilation rate in decapod crustaceans. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 77 (2), 369-371 (1984).
