Impedanz-Pneumographie zur minimalinvasiven Messung der Herzfrequenz bei Wirbellosen im Spätstadium
Summary
Die Messung der Herzfrequenz während einer thermischen Herausforderung gibt Einblick in physiologische Reaktionen von Organismen als Folge akuter Umweltveränderungen. Mit dem amerikanischen Hummer (Homarus americanus) als Modellorganismus beschreibt dieses Protokoll die Verwendung der Impedanz-Pneumographie als einen relativ nichtinvasiven und nichttödlichen Ansatz zur Messung der Herzfrequenz bei wirbellosen Wirbellosen im späten Stadium.
Abstract
Die Temperaturen in den Ozeanen steigen infolge der weitverbreiteten Veränderungen des Weltklimas rapide an. Da die Physiologie des Organismus stark von der Umgebungstemperatur beeinflusst wird, hat dies das Potenzial, die thermische physiologische Leistungsfähigkeit in einer Vielzahl von Meeresorganismen zu verändern. Mit dem amerikanischen Hummer (Homarus americanus) als Modellorganismus beschreibt dieses Protokoll die Verwendung von Impedanz-Pneumographie, um zu verstehen, wie sich die Kardialleistung in Wirbellosen im späten Stadium unter akutem thermischem Stress verändert. Das Protokoll stellt eine minimal-invasive Technik dar, die eine Echtzeit-Erfassung der Herzfrequenz während eines Temperatur-Ramping-Experiments ermöglicht. Daten können leicht manipuliert werden, um ein Arrhenius-Diagramm zu erzeugen, das verwendet wird, um arrhenius Bruchtemperatur (ABT) zu berechnen, die Temperatur, bei der die Herzfrequenz beginnt, mit steigenden Temperaturen zu sinken. Diese Technik kann in einer Vielzahl von Wirbellosen im späten Stadium (z. B. Krebse, Muscheln oder Garnelen) eingesetzt werden. Obwohl sich das Protokoll ausschließlich auf die Auswirkungen der Temperatur auf die Herzleistung konzentriert, kann es modifiziert werden, um das Potenzial für zusätzliche Stressoren (z. B. Hypoxie oder Hyperkapnie) zu verstehen, um mit der Temperatur zu interagieren, um die physiologische Leistung zu beeinflussen. Daher hat die Methode das Potenzial für weitreichende Anwendungen, um besser zu verstehen, wie wirbellose Meerestiere auf akute Veränderungen in der Umwelt reagieren.
Introduction
In den letzten Jahrzehnten hat die zunehmende Initigung von Treibhausgasen (d. h. Kohlendioxid, Methan und Lachgas) in die Atmosphäre zu weit verbreiteten Mustern der Umweltveränderung geführt1. Die Weltmeere erwärmen sich schnell2,3, ein Trend, der schwerwiegende Auswirkungen auf die Physiologie des Organismus haben kann. Die Temperatur beeinflusst stark die physiologischen Raten, und Organismen haben einen optimalen Temperaturbereich für Leistung4,5,6. Als solche, Einzelpersonen können Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung der richtigen Sauerstoffversorgung geweben auftreten, da Temperaturen außerhalb dieses Bereichs streunen. Dies hat das Potenzial, zu einem Rückgang der aeroben Leistung angesichts der Erwärmung der Ozeantemperaturenführen 5,7.
In einem Labor ist eine Methode, um die physiologischen Auswirkungen von Umweltveränderungen zu verstehen, die Herzleistung im Kontext von thermischem Stress zu untersuchen. Dies gibt einen Einblick, wie die Exposition gegenüber vorhergesagten Erwärmungsbedingungen Leistungskurven5,6 sowie das Potenzial für Akklimatität simponizität8verändern kann. Eine Vielzahl von Methoden wurden erfolgreich implementiert, um zuvor die Herzfrequenz bei wirbellosen Meerestieren zu messen. Viele dieser Techniken beinhalten jedoch eine chirurgische Entfernung oder größere Manipulation des Exoskeletts und eine längere Implantation von Messgeräten9,10,11, was zusätzliche Belastung für den Testgegenstand mit sich bringt und die Zeit erhöht, die für eine erfolgreiche Genesung vor dem Experimentieren benötigt wird. Darüber hinaus können weniger invasive Techniken (z. B. visuelle Beobachtung, Videographie) auf frühe Lebensverlaufsstadien beschränkt werden, wenn Organismen vollständig oder halbtransparent sein können12. Darüber hinaus können Forscher, die sich nicht mit technologisch fortschrittlicheren Methoden auskennen (z. B. Beobachtungen über Infrarot-Wandler oder Dopplerperfusion8,11), zusätzliche Herausforderungen stellen.
Dieses Protokoll verwendet den amerikanischen Hummer (Homarus americanus) als spätes Marine-Wirbellosenmodell, um die Verwendung von Impedanz-Pneumographie zur Beurteilung von Veränderungen der Herzfrequenz während eines Temperatur-Ramping-Experiments zu demonstrieren. Die Impedanz-Pneumographie beinhaltet die Weitergabe eines oszillierenden elektrischen Stroms (AC) über zwei Elektroden, die auf beiden Seiten des Perikards positioniert sind, um Spannungsänderungen zu messen, wenn sich das Herz zusammenzieht und entspannt13,14. Diese Technik ist minimal invasiv, da sie die Verwendung von kleinen Elektroden (d. h. 0,10–0,12 mm Durchmesser) verwendet, die sanft unter dem Exoskelett implantiert werden. Schließlich bietet es Echtzeit-Bewertungen der Herzfrequenz und Der Wassertemperatur während der Rampe durch den Einsatz eines Datenloggers.
Das Protokoll enthält auch Anweisungen zur Berechnung der Arrhenius Bruchtemperatur (ABT), die Temperatur, bei der die Herzfrequenz beginnt, mit steigenden Temperaturen13,15zu sinken. Die ABT dient als nicht-tödlicher Indikator für die thermische Kapazitätsgrenze bei Probanden, die gegenüber der Messung des kritischen thermischen Maximums (CTmax, die Obergrenze der Herzfunktion5,6) bevorzugt werden können, da tödliche Grenzwerte oft extrem und in der natürlichen Umgebung selten anzutreffen sind5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Impedanz-Pneumographie, um Veränderungen der Herzfrequenz von Wirbellosen im späten Stadium während eines Temperatur-Ramping-Experiments zu messen. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu anderen Labor-basierten Ansätzen9,10,11 ist, dass es minimal-invasiv ist und keine größere chirurgische Manipulation des Exoskeletts beinhaltet, wodurch die Menge der Erholungszeit vo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Paul Rawson für die Laborunterstützung und dem Preis der National Science Foundation IIA-1355457 an Maine EPSCoR an der University of Maine für die Mittel für den Kauf von Geräten. Dieses Projekt wurde vom USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch Projektnummer MEO-21811 durch die Maine Agricultural and Forest Experiment Station sowie dem NOAA National Marine Fisheries Service Saltonstall Kennedy Grant #18GAR039-136 unterstützt. Die Autoren danken auch drei anonymen Rezensenten für ihre Kommentare zu einer früheren Version dieses Manuskripts. Maine Agricultural and Forest Experiment Station Publikation Nummer 3733.
Materials
| 1.6 mm (1/16 in) drill bit | Milwaukee Tool at Home Depot | 1001294900 | This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores. |
| 38 AWG Copper Magnet Wire | TEMCo | MW0093 | This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes. |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 852882 | This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace. |
| Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade | Fisher BioReagents | BP82931GAL | This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Excel | Microsoft | N/A | This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems. |
| Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit | Fisher Scientific | 08-855 | This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol. |
| Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz | Fisher Scientific | 13-874-180 | This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use. |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK | Grainger | 5WHE6 | Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors. |
| Impedance converter | UFI | Model 2991 | Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three. |
| LabChart software | ADInstruments | N/A | Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes. |
| LED Soldering Iron | Grainger | 28EA35 | This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes. |
| PowerLab datalogger | ADInstruments | ML826 | There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel. |
| Prism8 | GraphPad | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems. |
| R | R Project | N/A | This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website. |
| Rosin Core Solder | Grainger | 331856 | This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes). |
| SAS | SAS Institute | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems. |
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | N/A | This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers. |
| T-type Pod | ADInstruments | ML312 | Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples. |
| T-type Thermocouple Probe | ADInstruments | MLT1401 | Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m. |
| UV Cable Tie, Black | Home Depot | 295813 | This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store. |
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