후기 무척추 동물에서 심박수의 최소 침습 측정을 위한 임피던스 폐색술
Summary
열 도전 중 심박수를 측정하면 급성 환경 변화의 결과로 생물의 생리적 반응에 대한 통찰력을 제공합니다. 모델 유기체로 미국 랍스터(Homarus americanus)를사용하여,이 프로토콜은 후기 무척추 동물에서 심장 박동을 측정하기 위해 상대적으로 비 침습적이고 비치명적인 접근법으로 임피던스 폐포의 사용을 설명합니다.
Abstract
바다의 온도는 세계 기후의 광범위한 변화의 결과로 급속하게 증가하고 있습니다. 생물 생리학은 환경 온도에 의해 크게 영향을, 이것은 해양 생물의 다양한 열 생리적 성능을 변경할 수있는 잠재력을 가지고있다. 모델 유기체로 미국 랍스터(Homarus americanus)를사용하여,이 프로토콜은 급성 열 스트레스에서 후기 무척추 동물의 심장 성능이 어떻게 변경되는지 이해하기 위해 임피던스 폐렴의 사용을 설명합니다. 이 프로토콜은 온도 램핑 실험 중에 심박수를 실시간으로 수집할 수 있는 최소 침습 기술을 제공합니다. 데이터를 쉽게 조작하여 아레니우스 브레이크 온도(ABT)를 계산하는 데 사용되는 아레니우스 플롯을 생성하며, 이는 온도가 증가함에 따라 심박수가 감소하기 시작하는 온도입니다. 이 기술은 다양한 후기 무척추 동물 (즉, 게, 홍합 또는 새우)에서 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 온도가 심장 성능에 미치는 영향에만 초점을 맞추고 있지만, 생리적 성능에 영향을 미치기 위해 온도와 상호 작용하는 추가 스트레스(예: 저산소증 또는 과다증)의 가능성을 이해하도록 수정할 수 있습니다. 따라서, 이 방법은 해양 무척추 동물이 환경의 급격한 변화에 어떻게 반응하는지 더 잘 이해할 수 있는 광범위한 응용 분야에 대한 잠재력을 가지고 있다.
Introduction
최근 수십 년 동안 온실 가스(즉, 이산화탄소, 메탄 및 아산화질소)가 대기중으로 투입되면서 환경 변화의 광범위한 패턴이 발생했습니다1. 세계의 바다는 급속하게 온난화2,,3,생물 생리학에 심각한 영향을 미칠 수있는 추세. 온도는 생리적 속도에 크게 영향을 미치며, 유기체는 성능4,,5,,6에대한 최적의 온도 범위를 가지고 있습니다. 이와 같이, 개인 온도이 범위를 벗어난 조직에 적절 한 산소 전달을 유지 에 어려움을 발생할 수 있습니다. 이는 온난화된 해양 온도5,,7에직면하여 호기성 성능 저하로 이어질 가능성이 있다.
실험실 환경에서 환경 변화의 생리적 영향을 이해하는 방법은 열 스트레스의 맥락에서 심장 성능을 검사하는 것입니다. 이것은 예측 된 온난화 조건에 노출이 성능 곡선5,,6뿐만 아니라 적응 가소성8에대한 가능성을 변경할 수있는 방법에 대한 통찰력을 제공합니다. 해양 무척추 동물의 심박수를 측정하기 위해 다양한 방법이 성공적으로 구현되었습니다. 그러나, 이러한 기술의 대부분은 외과 적 제거 또는 외골격의 주요9조작 및 측정 장치의 장기간 이식을 포함9,10,,11,이는 시험 대상에 추가 스트레스를 도입하고 실험 전에 성공적인 복구에 필요한 시간을 증가. 더욱이, 덜 침습적인 기술(예를 들어, 시각 관찰, 비디오그래피)은 유기체가 완전하거나 반투명할 수 있는 초기 생활 역사 단계로 제한될 수 있다12. 더욱이, 추가 도전은 더 기술적으로 진보된 방법론에 정통한 연구자에게 제시될 수 있습니다 (예를 들면, 적외선 트랜스듀서 또는 도플러관류를통한 관측8,11).
이 프로토콜은 온도 램핑 실험 동안 심박수의 변화를 평가하기 위한 임피던스 폐렴의 사용을 입증하기 위해 후기 해양 무척추 동물 모델로 미국 랍스터(Homarus americanus)를사용합니다. 임피던스 폐렴법은 심장이 수축하고13,,14를이완함에 따라 전압의 변화를 측정하기 위해 심낭의 양쪽에 위치한 두 개의 전극을 가로 질러 진동 전류 (AC)를 전달하는 것을 포함합니다. 이 기술은 외골격 바로 아래에 부드럽게 이식되는 작은 전극 (즉, 0.10-0.12 mm 직경)을 사용하기 때문에 최소 침습적입니다. 마지막으로, 데이터 로거를 사용하여 램프 동안 심박수와 수온을 실시간으로 평가합니다.
이 프로토콜은 또한 아레니우스 브레이크 온도(ABT)를 계산하기 위한 지침을 제공하며, 온도가13,,15증가함에 따라 심박수가 감소하기 시작하는 온도입니다. ABT는 치명적인 한계가 종종 극단적이고 자연환경에서거의 발생하지 않는 경우로서 임계 열 최대치(CTmax,심장 기능의 상한5,,6)를측정하는 데 선호될 수 있는 시험 대상자의 열 한계에 대한 비치명적인 지표로서 작용한다 5.
Protocol
1. 장비 설정 직경 약 8-10cm, 길이 40-70cm의 열 교환 코일을 만들기 위해 투명하고 가단성 튜브를 감싸십시오. 전기 테이프를 사용하여 코일을 고정합니다. 열 교환 코일을 외부 공급 장치에 부착하고 냉각/가열 순환 수조의 반품 피팅을 부착합니다. 호스 클램프를 사용하여 연결이 안전한지 확인합니다. 역삼투(RO) 물로 냉각/가열 순환 수조의 우물을 채우고 전원 코드를 콘센트…
Representative Results
이 프로토콜은 임피던스 폐포를 사용하여 온도 램핑 실험 중에 심박수(전압) 및 온도에 대한 실시간 데이터를 얻는 방법을 설명합니다. 이 기술을 천공할 때 기록된 전압 및 온도의 진폭은 실험 설계 및 초점 종에 따라 달라집니다. 그러나 실시간으로 표시되는 전압 출력은 프로토콜이 올바르게 구현될 때 일반 사위 분포를 따릅니다(그림1A). 경기장의 온도가 증가함에 따라 ?…
Discussion
이 프로토콜은 온도 램핑 실험 동안 후기 무척추 동물의 심박수 변화를 측정하기 위해 임피던스 폐포를 사용하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 주요 이점은 다른 실험실 기반9접근법9,10,,11에 비해 최소 침습적이며 외골격의 주요 외과 적 조작을 포함하지 않으므로 실험 전에 필요한 회복 시간의 양을 줄이는 것입니다. 또한 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 실험실 지원과 국립 과학 재단 상 IIA-1355457 장비를 구입하는 자금메인 대학에서 메인 EPSCoR에 폴 로슨 감사. 이 프로젝트는 USDA 국립 식량 농업 연구소, 해치 프로젝트 번호 MEO-21811 메인 농업 및 산림 실험 스테이션뿐만 아니라 NOAA 국립 해양 수산 서비스 살톤스톨 케네디 그랜트 #18GAR039-136에 의해 지원되었다. 저자는 또한이 원고의 이전 버전에 대한 자신의 의견에 대한 세 익명의 검토자에게 감사드립니다. 메인 농업 및 산림 실험 역 출판 번호 3733.
Materials
| 1.6 mm (1/16 in) drill bit | Milwaukee Tool at Home Depot | 1001294900 | This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores. |
| 38 AWG Copper Magnet Wire | TEMCo | MW0093 | This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes. |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 852882 | This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace. |
| Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade | Fisher BioReagents | BP82931GAL | This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Excel | Microsoft | N/A | This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems. |
| Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit | Fisher Scientific | 08-855 | This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol. |
| Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz | Fisher Scientific | 13-874-180 | This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use. |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK | Grainger | 5WHE6 | Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors. |
| Impedance converter | UFI | Model 2991 | Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three. |
| LabChart software | ADInstruments | N/A | Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes. |
| LED Soldering Iron | Grainger | 28EA35 | This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes. |
| PowerLab datalogger | ADInstruments | ML826 | There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel. |
| Prism8 | GraphPad | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems. |
| R | R Project | N/A | This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website. |
| Rosin Core Solder | Grainger | 331856 | This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes). |
| SAS | SAS Institute | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems. |
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | N/A | This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers. |
| T-type Pod | ADInstruments | ML312 | Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples. |
| T-type Thermocouple Probe | ADInstruments | MLT1401 | Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m. |
| UV Cable Tie, Black | Home Depot | 295813 | This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store. |
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Cite This Article
Harrington, A. M., Haverkamp, H., Hamlin, H. J. Impedance Pneumography for Minimally Invasive Measurement of Heart Rate in Late Stage Invertebrates. J. Vis. Exp. (158), e61096, doi:10.3791/61096 (2020).