Pneumografia de impedância para medição minimamente invasiva da freqüência cardíaca em invertebrados em estágio tardio
Summary
Medir a freqüência cardíaca durante um desafio térmico fornece uma visão das respostas fisiológicas dos organismos como conseqüência de mudanças ambientais agudas. Usando a lagosta americana (Homarus americanus) como um organismo modelo, este protocolo descreve o uso da pneumografia de impedância como uma abordagem relativamente não invasiva e não letal para medir a freqüência cardíaca em invertebrados em estágio tardio.
Abstract
As temperaturas nos oceanos estão aumentando rapidamente como consequência de mudanças generalizadas nos climas mundiais. Como a fisiologia organisma é fortemente influenciada pela temperatura ambiental, isso tem o potencial de alterar o desempenho fisiológico térmico em uma variedade de organismos marinhos. Usando a lagosta americana (Homarus americanus) como organismo modelo, este protocolo descreve o uso da pneumografia de impedância para entender como o desempenho cardíaco em invertebrados em estágio tardio muda sob estresse térmico agudo. O protocolo apresenta uma técnica minimamente invasiva que permite a coleta em tempo real da freqüência cardíaca durante um experimento de rampa de temperatura. Os dados são facilmente manipulados para gerar uma parcela de Arrhenius que é usada para calcular a temperatura de ruptura de Arrhenius (ABT), a temperatura em que a freqüência cardíaca começa a diminuir com o aumento das temperaturas. Esta técnica pode ser usada em uma variedade de invertebrados em estágio tardio (ou seja, caranguejos, mexilhões ou camarões). Embora o protocolo se concentre apenas no impacto da temperatura no desempenho cardíaco, ele pode ser modificado para entender o potencial de estressores adicionais (por exemplo, hipóxia ou hipercapnia) interagirem com a temperatura para influenciar o desempenho fisiológico. Assim, o método tem potencial para aplicações abrangentes para entender melhor como os invertebrados marinhos respondem a mudanças agudas no ambiente.
Introduction
Nas últimas décadas, o aumento da entrada de gases de efeito estufa (isto é, dióxido de carbono, metano e óxido nitroso) na atmosfera resultou em padrões generalizados de mudança ambiental1. Os oceanos do mundo estão aquecendo rapidamente2,3,uma tendência que pode ter impactos severos na fisiologia organismal. A temperatura influencia fortemente as taxas fisiológicas, e os organismos têm uma faixa de temperatura ideal para o desempenho4,5,6. Como tal, os indivíduos podem encontrar dificuldades em manter a entrega adequada de oxigênio aos tecidos à medida que as temperaturas se afastam dessa faixa. Isso tem o potencial de levar a declínios no desempenho aeróbico em face do aquecimento das temperaturas dos oceanos5,7.
Em um ambiente laboratorial, um método para entender os impactos fisiológicos das mudanças ambientais é examinar o desempenho cardíaco no contexto do estresse térmico. Isso fornece uma visão de como a exposição às condições de aquecimento previstas pode alterar as curvas de desempenho5,6, bem como o potencial de plasticidade de aclimatação8. Uma variedade de métodos foram implementados com sucesso para medir previamente a freqüência cardíaca em invertebrados marinhos. No entanto, muitas dessas técnicas envolvem remoção cirúrgica ou grande manipulação do exoesqueleto e implantação prolongada de dispositivos de medição9,10,11, que introduz estresse adicional ao sujeito do teste e aumenta o tempo necessário para uma recuperação bem sucedida antes da experimentação. Além disso, técnicas menos invasivas (por exemplo, observação visual, videografia) podem ser restritas aos estágios iniciais da história da vida quando os organismos podem ser totalmente ou semitransparentes12. Além disso, podem ser apresentados desafios adicionais aos pesquisadores que não são bem versados em metodologias tecnologicamente avançadas (por exemplo, observações via transdutores infravermelhos ou perfusão do Ppler8,11).
Este protocolo usa a lagosta americana (Homarus americanus) como um modelo de invertebrado marinho em estágio tardio para demonstrar o uso de pneumografia de impedância para avaliar mudanças na freqüência cardíaca durante um experimento de rampa de temperatura. A pneumografia de impedância envolve a passagem de uma corrente elétrica oscilante (AC) através de dois eletrodos posicionados em ambos os lados do pericárdio para medir mudanças de tensão à medida que o coração contrai e relaxa13,14. Esta técnica é minimamente invasiva, pois emprega o uso de pequenos eletrodos (ou seja, 0,10-0,12 mm de diâmetro) que são suavemente implantados logo abaixo do exoesqueleto. Finalmente, ele fornece avaliações em tempo real da freqüência cardíaca e temperatura da água durante a rampa através do uso de um data logger.
O protocolo também fornece instruções para calcular a temperatura de ruptura de Arrhenius (ABT), a temperatura em que a freqüência cardíaca começa a diminuir com o aumento das temperaturas13,15. O ABT serve como um indicador não letal do limite térmico de capacidade em cobaias que podem ser favorecidos sobre a medição do máximo térmico crítico (CTmax, o limite superior da função cardíaca5,6), pois os limites letais são muitas vezes extremos e raramente encontrados no ambiente natural5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve o uso de pneumografia de impedância para medir alterações na freqüência cardíaca de invertebrados de estágio tardio durante um experimento de rampa de temperatura. O principal benefício dessa técnica em comparação com outras abordagens baseadas em laboratório9,10,11 é que ela é minimamente invasiva e não envolve grande manipulação cirúrgica do exoesqueleto, reduzindo assim o tempo de rec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Paul Rawson pela assistência laboratorial e ao prêmio IIA-1355457 da Maine EPSCoR na Universidade do Maine por fundos para a compra de equipamentos. Este projeto foi apoiado pelo Instituto Nacional de Alimentos e Agricultura do USDA, o número do projeto Hatch MEO-21811 através da Estação de Experimentos Agrícolas e Florestais do Maine, bem como pelo Serviço Nacional de Pesca Marinha da NOAA Saltonstall Kennedy Grant #18GAR039-136. Os autores também agradecem a três revisores anônimos por seus comentários sobre uma versão anterior deste manuscrito. Maine Agricultural and Forest Experiment Station Publicação número 3733.
Materials
| 1.6 mm (1/16 in) drill bit | Milwaukee Tool at Home Depot | 1001294900 | This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores. |
| 38 AWG Copper Magnet Wire | TEMCo | MW0093 | This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes. |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 852882 | This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace. |
| Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade | Fisher BioReagents | BP82931GAL | This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Excel | Microsoft | N/A | This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems. |
| Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit | Fisher Scientific | 08-855 | This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol. |
| Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz | Fisher Scientific | 13-874-180 | This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use. |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK | Grainger | 5WHE6 | Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors. |
| Impedance converter | UFI | Model 2991 | Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three. |
| LabChart software | ADInstruments | N/A | Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes. |
| LED Soldering Iron | Grainger | 28EA35 | This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes. |
| PowerLab datalogger | ADInstruments | ML826 | There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel. |
| Prism8 | GraphPad | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems. |
| R | R Project | N/A | This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website. |
| Rosin Core Solder | Grainger | 331856 | This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes). |
| SAS | SAS Institute | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems. |
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | N/A | This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers. |
| T-type Pod | ADInstruments | ML312 | Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples. |
| T-type Thermocouple Probe | ADInstruments | MLT1401 | Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m. |
| UV Cable Tie, Black | Home Depot | 295813 | This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store. |
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