後期無脊椎動物における低侵襲性心拍数測定のためのインピーダンス肺撮影
Summary
熱的な挑戦の間に心拍数を測定する急性環境変化の結果として生物の生理学的応答への洞察を提供する。モデル生物としてアメリカのロブスター(ホマルス・アメリカヌス)を使用して、このプロトコルは、インピーダンス・ニューモグラフィーの使用を、後期無脊椎動物の心拍数を測定するための比較的非侵襲的で非致死的なアプローチとして記述する。
Abstract
世界の気候の広範な変化の結果として、海洋の気温は急速に上昇しています。生物生理学は環境温度の影響を大きく受けているため、さまざまな海洋生物の熱生理学的性能を変化させる可能性があります。アメリカのロブスター(ホマルス・アメリカヌス)をモデル生物として使用して、このプロトコルは、急性熱ストレス下での後期無脊椎動物の心臓性能がどのように変化するかを理解するためにインピーダンス肺撮影の使用を記述する。このプロトコルは、温度ランピング実験中に心拍数のリアルタイム収集を可能にする最小限の侵襲的な技術を提示する。データは、アレニウス破断温度(ABT)、心拍数が温度の上昇に伴って低下し始める温度を計算するために使用されるアレニウスプロットを生成するために簡単に操作されます。この技術は、さまざまな後期無脊椎動物(すなわち、カニ、ムール貝、またはエビ)で使用することができます。プロトコルは、心臓のパフォーマンスに対する温度の影響のみに焦点を当てていますが、追加のストレッサー(例えば、低酸素症または高カプニア)が温度と相互作用して生理学的性能に影響を与える可能性を理解するように変更することができます。したがって、この方法は、海洋無脊椎動物が環境の急激な変化にどのように反応するかをさらに理解するために、幅広い応用が可能である。
Introduction
ここ数十年で、温室効果ガス(すなわち、二酸化炭素、メタン、および亜酸化窒素)の大気中への流入の増加は、環境変化の広範なパターンを生じてきた1。世界の海洋は急速に温暖化している2,,3,生物生理学に深刻な影響を与える可能性がある傾向.温度は生理学的速度に大きく影響し、生物はパフォーマンス44、5、65,に最適な温度範囲を有する。したがって、個人は、この範囲外の温度が外れたため、組織への適切な酸素供給を維持する際に困難に遭遇する可能性があります。これは、温暖化する海洋温度5、7に直面して有酸素性能の低下につながる可能性5を秘めています。
実験室での環境環境における、環境変化の生理的影響を理解する方法は、熱ストレスの状況で心臓の性能を調べることである。これにより、予測された温暖化条件への暴露がパフォーマンス曲線55,66を変化させる方法と、順応可塑性8の可能性についての洞察が得られます。海洋無脊椎動物の心拍数を以前に測定するために、様々な方法がうまく実施されています。しかし、これらの技術の多くは、外骨格の外科的除去または主要な操作を伴い、測定装置99、10、1110の長期移植を伴い、被験者にさらなるストレスを与え、11実験前の回復に必要な時間を長くする。さらに、侵襲性の低い技術(例えば、視覚観察、ビデオ撮影)は、生物が完全または半透明である可能性がある初期の生命史段階に制限されてもよい。さらに、より技術的に高度な方法論(例えば、赤外線トランスデューサーまたはドップラー灌流8,8、11)に精通していない研究者にさらなる課題が提示される可能性がある。
このプロトコルは、温度暴走実験中の心拍数の変化を評価するためのインピーダンス肺分圧の使用を実証するために、後期の海洋無脊椎動物モデルとしてアメリカのロブスター(ホマルス・アメリカヌス)を使用する。インピーダンスニューモグラフィは、心膜の両側に配置された2つの電極に振動電流(AC)を通過させ、心臓が収縮して13,14,14に弛緩する際の電圧の変化を測定することを含む。この技術は、外骨格のすぐ下に穏やかに埋め込まれた小さな電極(すなわち、0.10〜0.12 mm)を使用するので、低侵襲である。最後に、データロガーを使用してランプ中の心拍数と水温の両方をリアルタイムで評価します。
プロトコルはまた、アレニウス破断温度(ABT)、心拍数が上昇温度13、15と共に減少し始める温度を計算するための指示を15提供します。ABTは、臨界熱最大(CTマックス、心機能5、66の上限)を測定する上で好まれる可能性のある被験者における能力の熱限界の非致死5的指標として機能し、致死的限界はしばしば極端であり、自然環境5ではめったに遭遇しない。
Protocol
1. 機器のセットアップ ラップクリアで可鍛性のチューブを囲んで、直径約8〜10cmの熱交換コイルを作成し、長さ40〜70cmの延長線を持ちます。電気テープを使用してコイルを固定します。 熱交換コイルを外部電源に取り付け、冷却/加熱循環水浴のフィッティングを返します。ホースクランプを使用して接続が確実に固定されていることを確認します。 冷却/加熱循環水浴…
Representative Results
このプロトコルは、温度上昇実験中の心拍数(電圧)と温度のリアルタイムデータを取得するためのインピーダンス・ニューモグラフィーの使用について説明しています。この技術を穿フォーする場合、記録される電圧と温度の振幅は、実験計画と焦点種に基づいて変化します。しかし、プロトコルが正しく実装されている場合、リアルタイムで表示される電圧出力は一般的な正気分布に従い?…
Discussion
このプロトコルは、温度ランピング実験中の後期無脊椎動物の心拍数の変化を測定するためのインピーダンス肺炎の使用について説明する。この技術の主な利点は、他の実験室ベースのアプローチ99、10、1110,11と比較して、それが低侵襲であり、外骨格の大きな外科的操作を伴わないことであり、実験前に必要な回復時間?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らはポール・ローソンの実験室支援に感謝し、国立科学財団はメイン大学のメインEPSCoRに機器を購入するための資金を授与するIIA-1355457を授与した。このプロジェクトは、メイン州農業林実験場を通じてUSDA国立食糧農業研究所、ハッチプロジェクト番号MEO-21811、およびNOAA国立海洋漁業サービスサルトンストールケネディグラント#18GAR039-136によって支援されました。著者らはまた、この原稿の以前のバージョンに関する彼らのコメントのために3人の匿名のレビュー担当者に感謝します。メイン州農業林実験ステーション出版番号3733。
Materials
| 1.6 mm (1/16 in) drill bit | Milwaukee Tool at Home Depot | 1001294900 | This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores. |
| 38 AWG Copper Magnet Wire | TEMCo | MW0093 | This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes. |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 852882 | This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace. |
| Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade | Fisher BioReagents | BP82931GAL | This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Excel | Microsoft | N/A | This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems. |
| Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit | Fisher Scientific | 08-855 | This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol. |
| Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz | Fisher Scientific | 13-874-180 | This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use. |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK | Grainger | 5WHE6 | Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors. |
| Impedance converter | UFI | Model 2991 | Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three. |
| LabChart software | ADInstruments | N/A | Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes. |
| LED Soldering Iron | Grainger | 28EA35 | This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes. |
| PowerLab datalogger | ADInstruments | ML826 | There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel. |
| Prism8 | GraphPad | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems. |
| R | R Project | N/A | This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website. |
| Rosin Core Solder | Grainger | 331856 | This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes). |
| SAS | SAS Institute | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems. |
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | N/A | This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers. |
| T-type Pod | ADInstruments | ML312 | Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples. |
| T-type Thermocouple Probe | ADInstruments | MLT1401 | Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m. |
| UV Cable Tie, Black | Home Depot | 295813 | This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store. |
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Cite This Article
Harrington, A. M., Haverkamp, H., Hamlin, H. J. Impedance Pneumography for Minimally Invasive Measurement of Heart Rate in Late Stage Invertebrates. J. Vis. Exp. (158), e61096, doi:10.3791/61096 (2020).