Måling av hjertefrekvens under en termisk utfordring gir innsikt i fysiologiske responser fra organismer som følge av akutt miljøendring. Ved hjelp av den amerikanske hummeren (Homarus americanus) som modellorganisme beskriver denne protokollen bruken av impedanspnematografi som en relativt ikke-invasiv og ikke-dødelig tilnærming for å måle hjertefrekvensen i sene fase virvelløse dyr.
Temperaturene i havene øker raskt som følge av omfattende endringer i verdens klima. Ettersom organismefysiologi er sterkt påvirket av miljøtemperatur, har dette potensial til å endre termisk fysiologisk ytelse i en rekke marine organismer. Ved hjelp av den amerikanske hummeren (Homarus americanus) som modellorganisme beskriver denne protokollen bruken av impedanspnematografi for å forstå hvordan hjerteytelsen i sen fase virvelløse dyr endres under akutt termisk stress. Protokollen presenterer en minimalinvasiv teknikk som gjør det mulig for sanntidsinnsamling av hjertefrekvens under et temperaturrampingseksperiment. Data manipuleres lett for å generere en Arrhenius-tomt som brukes til å beregne Arrhenius break temperature (ABT), temperaturen som hjertefrekvensen begynner å avta med økende temperaturer. Denne teknikken kan brukes i en rekke sene trinnvirvelløse dyr (dvs. krabber, blåskjell eller reker). Selv om protokollen fokuserer utelukkende på virkningen av temperatur på hjerteytelse, kan den endres for å forstå potensialet for ekstra stressfaktorer (f.eks hypoksi eller hyperkapni) for å samhandle med temperatur for å påvirke fysiologisk ytelse. Metoden har dermed potensial for omfattende applikasjoner for å forstå hvordan marine virvelløse dyr reagerer på akutte endringer i miljøet.
I de siste tiårene har økt inngang av klimagasser (dvs. karbondioksid, metan og lystgass) inn i atmosfæren resultert i omfattende miljøendringer1. Verdenshavene varmer raskt2,3, en trend som kan ha alvorlige konsekvenser for organismefysiologi. Temperatur påvirker fysiologiske priser, og organismer har et optimalt temperaturområde for ytelse4,5,6. Som sådan, enkeltpersoner kan oppleve vanskeligheter med å opprettholde riktig oksygenlevering til vev som temperaturer bortfra utenfor dette området. Dette har potensial til å føre til nedgang i aerob ytelse i møte med oppvarming havtemperaturer5,7.
I en laboratorieinnstilling er en metode for å forstå de fysiologiske konsekvensene av miljøendringer å undersøke hjerteytelsen i sammenheng med termisk stress. Dette gir innsikt i hvordan eksponering for forventede oppvarmingsforhold kan endre ytelseskurver5,,6 samt potensialet for akklimatiseringsplastisitet8. En rekke metoder er gjennomført for å tidligere måle hjertefrekvensen i marine virvelløse dyr. Imidlertid involverer mange av disse teknikkene kirurgisk fjerning eller større manipulering av eksoskjelettet og langvarig implantasjon av måleenheter9,10,11, som introduserer ekstra stress til testpersonen og øker tiden som trengs for en vellykket gjenoppretting før eksperimentering. Videre kan mindre invasive teknikker (f.eks. visuell observasjon, videografi) være begrenset til tidlige livshistoriestadier når organismer kan være helt ellerhalvgjennomsiktige 12. Videre kan ytterligere utfordringer presenteres for forskere som ikke er godt bevandret i mer teknologisk avanserte metoder (f.eks observasjoner via infrarøde transdusere eller Doppler perfusjon8,11).
Denne protokollen bruker den amerikanske hummeren (Homarus americanus) som en sen fase marine virvelløse modell for å demonstrere bruk av impedanspneumografi for å vurdere endringer i hjertefrekvensen under et temperaturrampingseksperiment. Impedans pneumography innebærer passering av en oscillerende elektrisk strøm (AC) over to elektroder plassert på hver side av perikardiet for å måle endringer i spenning som hjertet kontrakter og slapperav 13,14. Denne teknikken er minimalt invasiv, da den benytter bruk av små elektroder (dvs. 0,10–0,12 mm diameter) som forsiktig implanteres like under eksoskjelettet. Til slutt, det gir sanntidsvurderinger av både hjertefrekvens og vanntemperatur under rampen gjennom bruk av en datalogger.
Protokollen gir også instruksjoner for beregning av Arrhenius break temperature (ABT), temperaturen der hjertefrekvensen begynner å avta med økende temperaturer13,,15. ABT fungerer som en nonlethal indikator på den termiske grensen for kapasitet i testpersoner som kan favoriseres over å måle den kritiske termiske maksimum (CTmax, den øvre grensen for hjertefunksjon5,6), som dødelige grenser er ofte ekstreme og sjelden oppstått i det naturlige miljøet5.
Denne protokollen beskriver bruken av impedanspnematografi for å måle endringer i hjertefrekvensen til sene fasevirvelløse dyr under et temperaturrampingseksperiment. Den primære fordelen med denne teknikken sammenlignet med andre laboratoriebaserte tilnærminger9,10,11 er at den er minimalt invasiv og ikke involverer stor kirurgisk manipulering av eksoskjelettet, og reduserer dermed mengden restitusjonstid som trengs før e…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Paul Rawson for laboratoriehjelp og National Science Foundation award IIA-1355457 til Maine EPSCoR ved Universitetet i Maine for midler til å kjøpe utstyr. Dette prosjektet ble støttet av USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch prosjektnummer MEO-21811 gjennom Maine Agricultural and Forest Experiment Station, samt NOAA National Marine Fisheries Service Saltonstall Kennedy Grant #18GAR039-136. Forfatterne takker også tre anonyme anmeldere for sine kommentarer til en tidligere versjon av dette manuskriptet. Maine Landbruks- og skogseksperimentstasjon Publikasjon nummer 3733.
1.6 mm (1/16 in) drill bit | Milwaukee Tool at Home Depot | 1001294900 | This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores. |
38 AWG Copper Magnet Wire | TEMCo | MW0093 | This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes. |
Cyanoacrylate glue | Loctite | 852882 | This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace. |
Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade | Fisher BioReagents | BP82931GAL | This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
Excel | Microsoft | N/A | This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems. |
Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit | Fisher Scientific | 08-855 | This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol. |
Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz | Fisher Scientific | 13-874-180 | This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use. |
Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK | Grainger | 5WHE6 | Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors. |
Impedance converter | UFI | Model 2991 | Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three. |
LabChart software | ADInstruments | N/A | Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes. |
LED Soldering Iron | Grainger | 28EA35 | This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes. |
PowerLab datalogger | ADInstruments | ML826 | There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel. |
Prism8 | GraphPad | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems. |
R | R Project | N/A | This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website. |
Rosin Core Solder | Grainger | 331856 | This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes). |
SAS | SAS Institute | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems. |
SigmaPlot | Systat Software, Inc. | N/A | This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers. |
T-type Pod | ADInstruments | ML312 | Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples. |
T-type Thermocouple Probe | ADInstruments | MLT1401 | Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m. |
UV Cable Tie, Black | Home Depot | 295813 | This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store. |