Impedans pneumografi för minimalinvasiv mätning av hjärtfrekvens i sent stadium ryggradslösa djur
Summary
Mätning av hjärtfrekvens under en termisk utmaning ger insikt i organismernas fysiologiska reaktioner som en följd av akut miljöförändring. Med hjälp av den amerikanska hummern (Homarus americanus) som en modell organism, beskriver detta protokoll användningen av impedan pneumografi som en relativt noninvasive och nonlethal strategi för att mäta hjärtfrekvens i sent skede ryggradslösa djur.
Abstract
Temperaturerna i haven ökar snabbt till följd av omfattande förändringar i världens klimat. Eftersom organismfysiologi är starkt påverkad av miljötemperaturen, har detta potential att förändra termisk fysiologisk prestanda i en mängd olika marina organismer. Med hjälp av den amerikanska hummern (Homarus americanus) som en modell organism, beskriver detta protokoll användningen av impedan pneumografi för att förstå hur hjärtprestanda i sent skede ryggradslösa djur förändringar under akut termisk stress. Protokollet presenterar en minimalt invasiv teknik som möjliggör insamling av puls i realtid under ett experiment med temperaturrampning. Data manipuleras lätt för att generera en Arrhenius-tomt som används för att beräkna Arrhenius break temperature (ABT), den temperatur vid vilken hjärtfrekvensen börjar sjunka med ökande temperaturer. Denna teknik kan användas i en mängd sena steg ryggradslösa djur (dvs krabbor, musslor, eller räkor). Även om protokollet fokuserar enbart på temperaturens inverkan på hjärtprestanda, kan det modifieras för att förstå risken för ytterligare stressfaktorer (t.ex. hypoxi eller hyperkapni) att interagera med temperatur för att påverka fysiologiska prestanda. Metoden har således potential för omfattande tillämpningar för att ytterligare förstå hur marina ryggradslösa djur reagerar på akuta förändringar i miljön.
Introduction
Under de senaste decennierna har ökad tillförsel av växthusgaser (dvs. koldioxid, metan och dikväveoxid) i atmosfären lett till omfattande mönster för miljöförändringar1. Världens hav är snabbt uppvärmningen2,3, en trend som kan ha allvarliga effekter på organismfysiologi. Temperaturen påverkar kraftigt fysiologiska priser, och organismer har ett optimalt temperaturområde för prestanda4,,5,,6. Som sådan, individer kan stöta på svårigheter att upprätthålla korrekt syretillförsel till vävnader som temperaturer herrelösa utanför detta intervall. Detta har potential att leda till nedgångar i aerob prestanda inför uppvärmningen havstemperaturer5,7.
I en laboratoriemiljö är en metod för att förstå de fysiologiska effekterna av miljöförändringar att undersöka hjärtprestanda i samband med termisk stress. Detta ger insikt i hur exponering för förväntade uppvärmningsförhållanden kan förändra prestandakurvorna5,,6 samt potentialen för acklimatiseringsplastik8. En mängd olika metoder har framgångsrikt implementerats för att tidigare mäta hjärtfrekvens hos marina ryggradslösa djur. Emellertid, många av dessa tekniker innebär kirurgiskt avlägsnande eller större manipulation av exoskeleton och långvarig implantation av mätenheter9,10,11, som introducerar ytterligare stress till försökspersonen och ökar den tid som behövs för en lyckad återhämtning före experiment. Dessutom kan mindre invasiva tekniker (t.ex. visuell observation, videografi) begränsas till tidiga historiska stadier när organismer kan vara helt eller halvgenomskinliga12. Dessutom kan ytterligare utmaningar presenteras för forskare som inte är väl insatta i mer tekniskt avancerade metoder (t.ex. observationer via infraröda givare eller Doppler perfusion8,11).
Detta protokoll använder den amerikanska hummer (Homarus americanus) som ett sent stadium marina ryggradslösa modell för att visa användningen av impedans pneumografi för att bedöma förändringar i hjärtfrekvens under en temperatur rampning experiment. Impedans pneumografi innebär att en oscillerande elektrisk ström (AC) över två elektroder placeras på vardera sidan av hjärtsäcken för att mäta förändringar i spänning som hjärtat kontrakt och slappnarav 13,14. Denna teknik är minimalt invasiv, eftersom den använder sig av små elektroder (dvs. 0,10-0,12 mm diameter) som försiktigt implanteras strax under exoskelettet. Slutligen ger det realtidsbedömningar av både puls och vattentemperatur under rampen med hjälp av en datalogger.
Protokollet ger också instruktioner för beräkning av Arrhenius rasttemperatur (ABT), den temperatur vid vilken hjärtfrekvensen börjar sjunka med ökande temperaturer13,15. ABT fungerar som en nonlethal indikator på den termiska gränsen för kapacitet hos försökspersoner som kan gynnas framför mätning av den kritiska termiska högsta (CTmax, den övre gränsen för hjärtfunktion5,6), som dödliga gränser är ofta extrema och sällan påträffas i den naturliga miljön5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver användningen av impedans pneumografi för att mäta förändringar i hjärtfrekvensen av sent stadium ryggradslösa djur under en temperatur rampning experiment. Den primära fördelen med denna teknik jämfört med andra laboratoriebaserade metoder9,10,11 är att det är minimalt invasiv och inte innebär större kirurgisk manipulation av exoskelettet, vilket minskar mängden återhämtningstid som be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Paul Rawson för laboratoriestöd och National Science Foundation tilldelning IIA-1355457 till Maine EPSCoR vid University of Maine för medel för att köpa utrustning. Detta projekt stöddes av USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch projektnummer MEO-21811 genom Maine Agricultural and Forest Experiment Station, samt NOAA National Marine Fisheries Service Saltonstall Kennedy Grant #18GAR039-136. Författarna tackar också tre anonyma recensenter för deras kommentarer om en tidigare version av detta manuskript. Maine jordbruks- och skogexperiment posterar publikationen numrerar 3733.
Materials
| 1.6 mm (1/16 in) drill bit | Milwaukee Tool at Home Depot | 1001294900 | This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores. |
| 38 AWG Copper Magnet Wire | TEMCo | MW0093 | This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes. |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 852882 | This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace. |
| Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade | Fisher BioReagents | BP82931GAL | This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Excel | Microsoft | N/A | This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems. |
| Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit | Fisher Scientific | 08-855 | This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol. |
| Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz | Fisher Scientific | 13-874-180 | This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use. |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK | Grainger | 5WHE6 | Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors. |
| Impedance converter | UFI | Model 2991 | Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three. |
| LabChart software | ADInstruments | N/A | Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes. |
| LED Soldering Iron | Grainger | 28EA35 | This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes. |
| PowerLab datalogger | ADInstruments | ML826 | There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel. |
| Prism8 | GraphPad | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems. |
| R | R Project | N/A | This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website. |
| Rosin Core Solder | Grainger | 331856 | This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes). |
| SAS | SAS Institute | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems. |
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | N/A | This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers. |
| T-type Pod | ADInstruments | ML312 | Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples. |
| T-type Thermocouple Probe | ADInstruments | MLT1401 | Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m. |
| UV Cable Tie, Black | Home Depot | 295813 | This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store. |
References
- Stocker, T. F., et al. . Climate Change 2013: The Physical Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , (2013).
- Pershing, A. J., et al. Slow adaptation in the face of rapid warming leads to collapse of the Gulf of Maine cod fishery. Science. 350 (6262), 809-812 (2015).
- Smale, D. A., et al. Marine heat waves threaten global biodiversity and the provision of ecosystem services. Nature Climate Change. 9 (4), 306-316 (2019).
- Pörtner, H. O., Farrell, A. P. Physiology and climate change. Science. 322 (5902), 690-692 (2008).
- Pörtner, H. O., Bock, C., Mark, F. C. Oxygen- and capacity-limited thermal tolerance: bridging ecology and physiology. Journal of Experimental Biology. 220 (15), 2685-2696 (2017).
- Somero, G. N., Lockwood, B. L., Tomanek, L. . Biochemical adaptation: response to environmental challenges, from life’s origins to the Anthropocene. , (2017).
- Sokolova, I. M., Frederich, M., Bagwe, R., Lanning, G., Sukhotin, A. A. Energy homeostasis as an integrative tool for assessing limits of environmental stress tolerance in aquatic invertebrates. Marine Environmental Research. 79, 1-15 (2012).
- Tepolt, C. K., Somero, G. N. Master of all trades: thermal acclimation and adaptation of cardiac function in a broadly distributed marine invasive species, the European green crab, Carcinus maenas. Journal of Experimental Biology. 217 (7), 1129-1138 (2014).
- Frederich, M., Pörtner, H. O. Oxygen limitation of thermal tolerance defined by cardiac and ventilatory performance in spider crab, Maja squinado. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 279 (5), 1531-1538 (2000).
- Metzger, R., Sartoris, F. J., Langenbuch, M., Pörtner, H. O. Influence of elevated CO2 concentrations on thermal tolerance of the edible crab Cancer pagurus. Journal of Thermal Biology. 32, 144-151 (2007).
- Walther, K., Sartoris, F. J., Bock, C., Pörtner, H. O. Impact of anthropogenic ocean acidification on thermal tolerance of the spider crab Hyas araneus. Biogeosciences. 6 (10), 2207-2215 (2009).
- Styf, H. K., Sköld, H. N., Eriksson, S. P. Embryonic response to long-term exposure of the marine crustacean Nephrops norvegicus to ocean acidification. Ecology and Evolution. 3 (15), 5055-5065 (2013).
- Camacho, J., Qadri, S. A., Wang, H., Worden, M. K. Temperature acclimation alters cardiac performance in the lobster Homarus americanus. Journal of Comparative Physiology A. 192 (12), 1327-1334 (2006).
- Braby, C., Somero, G. N. Ecological gradients and relative abundance of native (Mytilus trossulus) and invasive (Mytilus galloprovincialis) blue mussels in the California hybrid zone. Marine Biology. 148 (6), 1249-1262 (2006).
- Stenseng, E., Braby, C. E., Somero, G. N. Evolutionary and acclimation-induced variation in the thermal limits of heart function in congeneric marine snails (Genus Tegula): implications for vertical zonation. Biological Bulletin. 208 (2), 138-144 (2005).
- Factor, J. . Biology of the Lobster: Homarus americanus. , (1995).
- Muggeo, V. M. Segmented: an R package to fit regression models with broken-lin relationships. R News. 8 (1), 20-25 (2008).
- Ryan, S. E., Porth, L. S. A tutorial on the piecewise regression approach applied to bedload transport data. General Technical Report RMS-GTR-189. , (2007).
- . . Prism8 Statistics Guide. , (2020).
- Cuculescu, M., Hyde, D., Bowler, K. Thermal tolerance of two species of marine crab, Cancer pagurus and Carcinus maenas. Journal of Thermal Biology. 23 (2), 107-110 (1998).
- Stillman, J. H. A comparative analysis of plasticity of thermal limits in porcelain crabs across latitudinal and intertidal zone clines. International Congress Series. 1275, 267-274 (2004).
- Maderia, D., et al. cellular and biochemical thermal stress response of intertidal shrimps with different vertical distributions: Palaemon elegans and Palaemon serratus. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A. 183, 107-115 (2015).
- Padilla-Ramirez, S., et al. The effects of thermal acclimation on the behavior, thermal tolerance, and respiratory metabolism in a crab inhabiting a wide range of thermal habitats (Cancer antennarius Stimpson, 1856, the red shore crab). Marine and Freshwater Behaviour and Physiology. 48 (2), 89-101 (2017).
- Pörtner, H. O. Ecosystem effects of ocean acidification in times of ocean warming: a physiologist’s view. Marine Ecology Progress Series. 373, 203-217 (2008).
- Pörtner, H. O. Oxygen- and capacity-limitation of thermal tolerance: a matrix for integrating climate-related stressor effects in marine ecosystems. Journal of Experimental Biology. 213 (6), 881-893 (2010).
- Zittier, Z. M. C., Hirse, T., Pörtner, H. O. The synergistic effects of increasing temperature and CO2 levels on activity capacity and acid-base balance in the spider crab, Hyas araneus. Marine Biology. 160 (8), 2049-2062 (2013).
- Harrington, A. M., Hamlin, H. J. Ocean acidification alters thermal cardiac performance, hemocyte abundance, and hemolymph chemistry in subadult American lobsters Homarus americanus H. Milne Edwards, 1837 (Decapoda: Malcostraca: Nephropidae). Journal of Crustacean Biology. 39 (4), 468-476 (2019).
- Depledge, M. H. Photoplethysmography – a non-invasive technique for monitoring heart beat and ventilation rate in decapod crustaceans. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 77 (2), 369-371 (1984).
