يسمح هذا البروتوكول بإعداد أقسام عرضية من بذور الحبوب (مثل الأرز) لتحليل مورفولوجيا حبيبات الإندوسبيرم والنشا باستخدام المجهر الإلكتروني المسح الضوئي.
تظهر حبيبات النشا (SGs) مورفولوجيا مختلفة اعتمادا على أنواع النباتات ، خاصة في بطانة عائلة Poaceae. يمكن استخدام الفينوتينينج الإندوسبيرم لتصنيف الأنماط الجينية على أساس النمط المورفوبي SG باستخدام تحليل المجهر الإلكتروني المسح الضوئي (SEM). يمكن تصور SGs باستخدام SEM عن طريق تشريح من خلال النواة (pericarp، طبقات aleurone، و endosperm) وفضح محتويات organellar. تتطلب الطرق الحالية أن تكون نواة الأرز جزءا لا يتجزأ من الراتنج البلاستيكي وتقسم باستخدام ميكروتوم أو جزءا لا يتجزأ من طرف ماصة مبتورة ومقسمة باليد باستخدام شفرة حلاقة. وتتطلب الطريقة الأولى معدات متخصصة وتستغرق وقتا طويلا، في حين أن الطريقة الثانية تطرح مجموعة جديدة من المشاكل تبعا للنمط الجيني للأرز. أصناف الأرز الطباشيري، على وجه الخصوص، تشكل مشكلة لهذا النوع من الأقسام بسبب الطبيعة القابلة للتفتيت من أنسجة الاندوسبيرم الخاصة بهم. هنا هو تقنية لإعداد شفافة والطباشيري أقسام نواة الأرز للفحص المجهري، تتطلب نصائح ماصة فقط وشفرة مشرط. إعداد المقاطع داخل حدود طرف ماصة يمنع نواة الأرز الاندوسبيرم من التحطم (للأنماط الظاهرية شفافة أو “الزجاجية”) وتنهار (للأنماط الظاهرية الطباشيرية). باستخدام هذه التقنية، يمكن ملاحظة نقوش الخلايا الداخلية وبنية SGs سليمة.
حبيبات النشا (SGs) معرض مورفولوجيا مختلفة اعتمادا على الأنواع النباتية، وخاصة في endosperm من عائلة Poaceae 1،2. يمكن استخدام الفينوتينينج الإندوسبيرم لتصنيف الأنماط الجينية على أساس النمط الظاهري SG باستخدام التحليل المجهري الإلكتروني المسح الضوئي. يمكن تصور SGs باستخدام المسح المجهري الإلكتروني (SEM) عن طريق تقطيع النواة والتطفل بعيدا جدران الخلايا endosperm2.
الغرض من هذه التقنية هو إعداد أقسام نواة الأرز العرضية بسهولة فقط لتحليل SEM السريع. وكان الدافع وراء تطوير هذه التقنية هو ضرورة اتباع نهج سريع للتجزأ العرضي يتم بموجبه إعداد العينات للفحص المجهري ل SEM مباشرة قبل التصور باستخدام الحد الأدنى من المعدات.
تتضمن هذه التقنية إدخال نواة الأرز المقشورة في طرف المصصة للشلل التام. وهذا مهم بشكل خاص عند المقاطع العرضية الأنماط الظاهرية نواة الأرز طباشيري، والتي هي قابلة للتفتيت وتنهار بسهولة تحت الضغط3. الطباشيرية هي نوعية غير مرغوب فيها في الأرز لأنها تؤثر على مظهر النواة وتسبب النواة لكسر بسهولة أثناء تلميع وطحن3. Chalkiness يقدم كمنطقة مبهمة في مقطع عرضي من النواة التي يمكن ملاحظتها بالعين المجردة. على المستوى المجهري ، يتميز الطباشير حبيبات النشا الصغيرة المعبأة بشكل فضفاض. أسباب الطباشير يمكن أن تكون وراثية4،5 أوالبيئية 6،7.
وقد تم تقليديا إعداد المقاطع العرضية بذور الحبوب باستخدام أساليب تحديد المواد الكيميائية والتقطيع بعد تضمين عينة في شمع البارافين أو مصفوفة صلبة أخرى4،8،9،10. في عام 2010، تم إدخال طريقة ماتسوشيما كوسيلة لتجنب معقدة وتستغرق وقتا طويلا إعداد عينة نواة الأرز4. تضمن هذا الأسلوب إدراج نواة الأرز المقشورة في طرف ماصة مبتور. يتم الاحتفاظ بالطرف ثابتا بواسطة أداة تشذيب الكتلة ، ويتم حصاد أقسام الإندوسبيرم الجزئية الرقيقة باستخدام شفرة حلاقة يدوية. تقنية سريعة أخرى تم تطويرها في عام 2016 سمحت بقسمة كاملة رقيقة من مجموعة واسعة من البذور الجافة ، بما في ذلك الأصناف الطباشيرية10. هذه الأساليب حفزت على تطوير تقنية سريعة المعروضة هنا.
هذه التقنية الجديدة مناسبة للباحثين الذين يرغبون في الحصول على مقاطع عرضية سليمة من حبات الأرز لenotyping endosperm وتحليل مورفولوجيا النشا باستخدام SEM.
يمثل هذا البروتوكول تكييفا لطريقة تلميح ماصة ماصة Matsushima المبتورة4، مع العديد من التعديلات الملحوظة: (1) لا يتم إدخال حبات في أي نقطة من هذه التقنية ؛ (1) لا يتم إدخالها في أي نقطة من هذه التقنية؛ (1) يتم إدخال تعديلات على 1. (2) لا يطلب من أداة تشذيب الكتلة أو البروتينات الفائقة إعداد المقاطع. نوع البرية ‘شفافة’ أصناف (Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare) وخط “طباشيري” محمود من نيبونباري (ssg1, دون المستوى النشا grain1)4 تم فحصها في هذه الدراسة. وقد تم اختيار هذين الصنفين للتحليل هنا لإظهار الاختلافات التقنية والبصرية في معالجة أقسام الأرز الشفافة والطباشيرية.
تمثل التقنية المعروضة هنا نهجا سريعا وبسيطا وحريصا نحو إعداد مقاطع عرضية من الأرز لتصور SEM على سطح المكتب. تسمح تقنية الأقسام هذه بالملاحظة السريعة لهيكل الاندوسبيرم وشكل الخلية الداخلية والحجم والنمط وحبيبات المركب ومورفولوجيا النشا. لأغراض الفينوتيبينج إندوسبيرم وفحص الجرثومة، فمن الأهمية بمكان الحصول على مقطع عرضي كامل من نواة الأرز4،23،24. من الأهمية بمكان إدراج النواة بالكامل داخل طرف ماصة لمنع ضغط شفرة المشرط من إجبار الاندوسبيرم على الانهيار أو التحطم. شريطة أن يتم بناء تجميع “التلسكوب” بشكل صحيح ، يمكن إعداد العينات للتصور في غضون 15 ثانية(الجدول 2)باستخدام المواد الموجودة بالفعل في إعداد مختبر نموذجي. وتنطبق هذه التقنية على المقطع العرضي لأي بذرة بيضاوية قطرها حوالي أربعة ملليمترات في أوسع نقطة لها. بذور العشب نموذج Brachypodium distachyon (الشكل S2A) يمكن تقسيمها بالمثل ولكن لا تبقى مغلقة داخل annulus. بذور أكبر، مثل القمح، كسر بسهولة وتتطلب الرعاية عند تقسيم (الشكل S2B).
ومع ذلك ، هناك العديد من القيود على هذه التقنية المعروضة هنا. المقاطع التي تم الحصول عليها باستخدام هذه التقنية ليست رقيقة بما يكفي للضوء لتمرير من خلالها الذي يحظر استخدام هذه التقنية للنهج المجهرية المرسلة على أساس الضوء مثل حقل مشرق (500 ميكرومتر سمك العينة القصوى لأقسام نواة الأرز25) ونقل المجهر الإلكتروني (TEM) (500 نانومتر سمك العينة القصوى26 ). استخدام طرف ماصة كما “مصفوفة” المقطع يحد أيضا من حجم البذور التي يمكن تقسيمها باستخدام هذه التقنية. وستكون هناك حاجة إلى مزيد من استكشاف الأخطاء وإصلاحها لتكييف هذه التقنية للأنواع التي تختلف كثيرا عن الأرز، ويقتصر حجم “المصفوفة” على حجم نصائح ماصة المتاحة للشراء.
ميزة أخرى متميزة أن هذه التقنية يوفر هو نوعية العينات التي يمكن أن تنتج من حبات الأرز النمط الظاهري طباشيري. تجدر الإشارة إلى أنه حتى دراسة ماتسوشيما أقرت بأنه كان من الصعب الحصول على مقاطع عرضية باستخدام هذه الطريقة الخاصة للأنماط الظاهرية الطباشيرية4، كما تكررت في هذه الدراسة لغرض المقارنة(الشكل 1S). في حالتهم ، أصبح من الضروري إصلاح عينات الأرز الطباشيري الخاصة بهم كيميائيا وتضمينها في الراتنج للقسم. تقنية جديدة، جنبا إلى جنب مع التصوير SEM سطح المكتب، يسمح للباحث لإعداد بسهولة أقسام عرضية من حبات الأرز للفحص المجهري مع مزيد من الاتساق من دون دعم شل الحركة(الجدول 3).
في العصر الجديد من علم وظائف الأعضاء ونواتج الأيض ، من المهم مراقبة الخطوط المبوبة والمكتبات الموسومة بالتناسب لفهم وظيفة وأهمية النشا في البذور بشكل أفضل. بالإضافة إلى ذلك، فإن جينبنك الأرز الدولي يحمل أكثر من 130 000 انضمام الأرز27. تقنية الفينوتيبينج البذور السريعة مثل تلك المعروضة هنا من شأنه أن يعجل التصنيف وأخذ العينات للجودة الغذائية28. وأخيرا، قد تكون هذه التقنية مفيدة في ضوء التعدي على آثار تغير المناخ. وقد تم بالفعل تحديد الإجهاد الموسمي في درجة الحرارة العالية أثناء ملء الحبوب كسبب رئيسي للطباشير6، ولكن الدراسات الحديثة تورطت في ارتفاع درجات الحرارة العالمية في زيادة الطباشير من غلة الأرز7،29. وقد تساعد هذه الفينوتيبينج المعجلة للاندوسبيرم في توفير صورة زراعية واسعة النطاق لتأثير زيادة درجات الحرارة العالمية.
The authors have nothing to disclose.
authors ممتنون لأنظمة للبحوث (SFR كورب) لاستخدامها فينوم ProX سطح المكتب SEM الصك ، وكذلك للمساعدة التقنية التي تقدمها ماريا Pilarinos (نظم البحوث (SFR) كورب) وكلوي فان Oostende – الثلاثي (بيولوجيا الخلية والحصول على صورة مرفق الأساسية ، كلية الطب ، جامعة أوتاوا). تم توفير التمويل من قبل صندوق الابتكار منخفض الكربون (LCIF) من وزارة التنمية الاقتصادية وخلق فرص العمل والتجارة في حكومة أونتاريو، وشركة البروتينات السهلة.
JMP 15 | SAS | N/A | N/A |
Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100) | Agar Scientific | AGG3347N | N/A |
Phenom Pro Desktop SEM | Thermo Scientific | PHENOM-PRO | N/A |
Pipette Tips RC UNV 250 µL | Rainin | 17001116 | N/A |
SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium | Micro to Nano | 10-002012-50 | N/A |
Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm | Thermo Scientific | 3120019 | N/A |
Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm | Thermo Scientific | 28618256 | N/A |
Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle | Thermo Scientific | 5334 | N/A |
Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope | Zeiss | N/A | N/A |