פרוטוקול זה מאפשר הכנת קטעים רוחביים של זרעי דגנים (למשל, אורז) לניתוח של מורפולוגיה של אנדוספרם וגרגר עמילן באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת.
גרגירי עמילן (SGs) מציגים מורפולוגיות שונות בהתאם למין הצמח, במיוחד באנוספרם של משפחת Poaceae. פנוטיפינג אנדוספרם יכול לשמש לסיווג גנוטיפים המבוססים על מורפוטיפ SG באמצעות סריקת ניתוח מיקרוסקופי אלקטרונים (SEM). ניתן לדמיין SGs באמצעות SEM על ידי חיתוך דרך הליבה (pericarp, שכבות אלורון ואנוספרם) וחשיפת התוכן האורגני. השיטות הנוכחיות דורשות את ליבת האורז להיות מוטבעת בשרף פלסטיק ומדורקת באמצעות מיקרוטום או מוטבעת בקצה פיפטה קטועה ומקטעת ביד באמצעות סכין גילוח. השיטה הקודמת דורשת ציוד מיוחד והיא גוזלת זמן רב, בעוד האחרונה מציגה שורה חדשה של בעיות בהתאם לגנוטיפ אורז. זני אורז גיר, במיוחד, מהווים בעיה עבור סוג זה של חתך בשל האופי הפריך של רקמת האנוספרם שלהם. מוצג כאן טכניקה להכנת קטעי גרעיני אורז שקופים וגיריים למיקרוסקופיה, הדורשת רק טיפים פיפטה ולהב אזמל. הכנת החלקים בתוך גבולות טיפ פיפטה מונעת מאנדופרם גרעיני אורז להתנפץ (עבור פנוטיפים שקופים או ‘זגועים’) ולהתפורר (עבור פנוטיפים גיר). באמצעות טכניקה זו, דפוס תא אנדוספרם ואת המבנה של SGs שלם ניתן לראות.
גרגירי עמילן (SGs) מציגים מורפולוגיות שונות בהתאם למין הצמחים, במיוחד באנוספרם של משפחת פואצ’אי 1,2. פנוטיפינג אנדוספרם יכול לשמש לסווג גנוטיפים המבוססים על פנוטיפ SG באמצעות סריקת ניתוח מיקרוסקופי אלקטרונים. ניתן לדמיין SGs באמצעות סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM) על ידי חיתוך הקרנל וחטטנות קירות תא אנדוספרם2.
מטרת טכניקה זו היא להכין בקלות מקטעי גרעיני אורז רוחביים אך ורק לניתוח SEM המהיר. הפיתוח של טכניקה זו הונע על ידי הצורך בגישה מהירה של חתך מהיר לפיה דגימות מוכנות למיקרוסקופיית SEM מיד לפני הדמיה באמצעות ציוד מינימלי.
טכניקה זו כוללת החדרת גרעין האורז הקלוף לתוך קצה הפיפטה לשתק מוחלט. זה חשוב במיוחד בעת חתך פנוטיפים גרעיני אורז גיר, אשר פריך בקלות להתפורר תחת לחץ3. גיר הוא איכות לא רצויה באורז שכן היא משפיעה על המראה של הקרנל וגורמת לליבה להישבר בקלות במהלך ליטוש וכרסום3. גיר מציג כאזור אטום בחתך של הקרנל שניתן לראות בעין בלתי מזוינת; ברמה המיקרוסקופית, הגיר מאופיין בגרגרי עמילן קטנים ארוזים באופן רופף. גורמים לגיר יכול להיות גנטי4,5 או סביבתי6,7.
חתך זרעי דגנים הוכנו באופן מסורתי בשיטות תיקון כימיות וחתך בעקבות דגימה הטמעה שעוות פרפין או מטריצה מוצקה אחרת4,8,9,10. בשנת 2010, שיטת Matsushima הוצגה כדרך להימנע מהכנת מדגם גרעיני אורז מסובך וגוזל זמן4. שיטה זו כללה החדרת גרעין האורז הקלוף לקצה פיפטה קטוע. הקצה מוחזק נייח על ידי גוזם בלוקים, וחלקים דקים וחלקיים של אנדופרם נקצרים באמצעות סכין גילוח ידני. טכניקה מהירה נוספת שפותחה בשנת 2016 אפשרה חתך שלם דק של מגוון רחב של זרעים יבשים, כולל זניםגיר 10. שיטות אלה הניעה את התפתחות הטכניקה המהירה המוצגת כאן.
טכניקה חדשה זו מתאימה לחוקרים שרוצים להשיג חתך רוחבי שלם של גרעיני אורז עבור פנוטיפינג אנדוספרם וניתוח מורפולוגיה עמילן באמצעות SEM.
פרוטוקול זה מייצג התאמה של שיטת קצה פיפטה חתוכה Matsushima4, עם כמה שינויים בולטים: (1) גרעינים אינם imbibed בכל שלב של הטכניקה; (2) לא גוזם בלוק ולא ultramicrotome נדרשים להכין את המקטעים. סוג פראי ‘שקוף’ cultivar(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare) וקו ‘גיר’ מוטגני של Nipponbare (ssg1, גרגר עמילן לא תקני1)4 נבדקו במחקר זה. שני הכתות האלה נבחרו לניתוח כאן כדי להדגים את ההבדלים הטכניים והוויזואליים בעיבוד מקטעי אורז שקופים וגיריים.
הטכניקה המוצגת כאן מייצגת גישה מהירה, פשוטה וחדה לקראת הכנת חתך אורז רוחבי להדמיית SEM שולחנית. טכניקת חתך זו מאפשרת תצפית מהירה של מבנה אנדוספרם, צורת תא אנדוספרם, גודל ותבנית, גרגירים מורכבים ומורפולוגיה של עמילן. לצורך סינון פנוטיפינג אנדוספרם ונבטים, חיוני להשיג חתך שלם של גרעין האורז4,23,24. חשוב ביותר להכניס את הקרנל כולו בתוך קצה הפיפטה כדי למנוע את הלחץ של להב האזמל מלאלץ את האנוספרם להתפורר או להתנפץ. בתנאי שהרכבת ‘הטלסקופ’ בנויה כראוי, ניתן להכין דגימות להדמיה תוך 15 שניות(טבלה 2)תוך שימוש בחומרים שכבר נמצאים ביד בסביבת מעבדה טיפוסית. טכניקה זו חלה על חתך רוחב של כל זרע אליפסואידי כארבעה מילימטרים בקוטר בנקודה הרחבה ביותר שלה. זרעי דגם הדשא Brachypodium distachyon (איור S2A) ניתן לחלק באופן דומה אך אינם נשארים סגורים בתוך אנולוס. זרעים גדולים יותר, כמו חיטה, שבר בקלות ודורשים טיפול בעת חתך(איור S2B).
עם זאת, ישנן מספר מגבלות לטכניקה המוצגת כאן. חלקים שהושגו בטכניקה זו אינם דקים מספיק כדי שהאור יעבור דרכה אוסר על שימוש בטכניקה זו לגישות מיקרוסקופיות מבוססות אור משודר כמו שדה בהיר (עובי מדגם מרבי של 500 מיקרומטר עבור חלקי ליבת אורז25) ומיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM) (500 ננומטר עובי מדגם מרבי26 ). השימוש בקצה פיפטה כ’מטריצה ‘ של חתך מגביל גם את גודל הזרע שניתן לחלק באמצעות טכניקה זו. פתרון בעיות נוסף יידרש כדי להתאים טכניקה זו עבור מינים שונים מאוד מאורז, ואת הגודל של “מטריצה” מוגבל על ידי גודל טיפים pipette זמין לרכישה.
יתרון מובהק נוסף שטכניקה זו מספקת הוא איכות הדגימות שניתן להפיק מגרעיני אורז פנוטיפ גיר. ראוי לציין כי אפילו מחקר Matsushima הודה כי היה קשה להשיג חתך בשיטה מסוימת זו עבור פנוטיפיםגיר 4, כפי ששוכפל במחקר זה לצורך השוואה (איור 1S). במקרה שלהם, היה צורך לתקן כימית דגימות אורז גיר שלהם ולהטביע אותם שרף לחתך. הטכניקה החדשה, בשילוב עם הדמיית SEM שולחנית, מאפשרת לחוקר להכין בקלות חלקים רוחביים של גרעיני אורז למיקרוסקופיה עם עקביות רבה יותר מאשר ללא תמיכה בלי תנועה (טבלה 3).
בעידן החדש של פנומיקה ומטבולומיה, חשוב לפקח על קווים מוטגניים וספריות מתויגות טרנספוסון כדי להבין טוב יותר את הפונקציה והחשיבות של עמילן בזרעים. בנוסף, ג’נבנק רייס הבינלאומי מחזיק מעל 130,000 גישות אורז27. טכניקת פנוטיפינג זרעים מהירה כמו זו המוצגת כאן תזרז סיווג ודגימה לאיכות תזונתית28. לבסוף, טכניקה זו עשויה להיות שימושית לאור השפעות שינוי האקלים פולש. מתח עונתי בטמפרטורה גבוהה במהלך מילוי תבואה כבר זוהה כגורם העיקרי לגיר6, אבל מחקרים אחרונים סיבכו את עליית הטמפרטורות העולמיות בהגדלת הגיר של תשואות אורז7,29. פנוטיפינג אנדוספרם מזורז כזה עשוי לעזור לספק תמונה חקלאית רחבה של ההשפעה של עליית הטמפרטורות העולמיות.
The authors have nothing to disclose.
המחברים אסירי תודה למערכות למחקר (SFR Corp.) על השימוש במכשיר הפנומן ProX Desktop SEM שלהם, כמו גם על הסיוע הטכני המסופק על ידי מריה פילרינוס (מערכות למחקר (SFR) קורפ) ו Chloë van Oostende-Triplet (ביולוגיה של התא ומתקן הליבה לרכישת תמונה, הפקולטה לרפואה, אוניברסיטת אוטווה). המימון ניתן על ידי קרן החדשנות דלת הפחמן (LCIF) ממשרד הפיתוח הכלכלי של אונטריו, יצירת מקומות עבודה וסחר, וחלבונים קלים קורפ.
JMP 15 | SAS | N/A | N/A |
Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100) | Agar Scientific | AGG3347N | N/A |
Phenom Pro Desktop SEM | Thermo Scientific | PHENOM-PRO | N/A |
Pipette Tips RC UNV 250 µL | Rainin | 17001116 | N/A |
SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium | Micro to Nano | 10-002012-50 | N/A |
Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm | Thermo Scientific | 3120019 | N/A |
Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm | Thermo Scientific | 28618256 | N/A |
Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle | Thermo Scientific | 5334 | N/A |
Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope | Zeiss | N/A | N/A |