このプロトコルは、走査型電子顕微鏡を用いた、胚乳およびデンプン顆粒形態の分析のための穀物種子(例えば米)の横断切片の調製を可能にする。
デンプン顆粒(SG)は、植物種、特に ポアセ科 の胚乳に応じて異なる形態を示す。子宮内精子表現型は走査型電子顕微鏡(SEM)解析を用いてSG形態型に基づく遺伝子型を分類するために使用することができる。SGは、カーネル(pericarp、アローロン層、および子宮内精子)をスライスし、オルガネラ属の内容物を露出させることによって、SEMを使用して可視化することができる。現在の方法では、米のカーネルをプラスチック樹脂に埋め込み、ミクロトームを使用して切り離すか、切り捨てられたピペットチップに埋め込み、カミソリの刃を使用して手で切り離す必要があります。前者の方法は特殊な設備を必要とし、時間がかかり、後者は米の遺伝子型に応じて新しい問題を導入します。チョーク米の品種は、特に、彼らの子宮内精子組織の不可解な性質のために、このタイプの断面に問題を提起する。ここでは、ピペットの先端とメスの刃のみを必要とする顕微鏡用の半透明およびチョーク米カーネルセクションを準備するための技術です。ピペットチップの範囲内でセクションを準備すると、米カーネルの胚乳が粉々になり(半透明または「膜状」の)、崩れ(チョーク状のフェノタイプの場合)を防ぐことができます。この手法を用い、無傷のSGの細胞パターニングや構造を観察できる。
デンプン顆粒(SG)は、植物種によって異なる形態を呈し、特にポアセ科1,2の胚乳では特に。子宮内精子表現型は走査型電子顕微鏡分析を用いてSG表現型に基づく遺伝子型を分類するために使用することができる。SGは、走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて、カーネルをスライスし、子宮内精子細胞壁2を掻き取ることによって可視化することができる。
この技術の目的は、高速SEM分析のためだけに、簡単に横米カーネルセクションを準備することです。この技術の開発は、最小限の装置を使用して可視化する直前にサンプルをSEM顕微鏡用に調製する迅速な断面アプローチの必要性によって動機づけられました。
この技術は、完全な固定化のために、ピペットチップに殻を押した米のカーネルを挿入することを含む。これは、チョーク米カーネルの異型を横断する際に特に重要であり、これは、圧力3の下で容易に崩れ落ちやすい。チョークは、カーネルの外観に影響を与え、研磨と粉砕の間にカーネルが壊れやすい原因となるので、米の望ましくない品質です 3.チョークは、肉眼で観察できるカーネルの断面の不透明な領域として提示します。顕微鏡レベルでは、チョークは小さく、緩く詰まったデンプン顆粒によって特徴付けられる。チョークの原因は、遺伝的な4、5または環境6、7である可能性があります。
穀類種子の断面は、パラフィンワックスまたは別の固体マトリックス4、8、9、10に埋め込まれたサンプルに続く化学的固定法および断面を使用して伝統的に調製されてきた。2010年には、複雑で時間のかかる米のカーネルサンプル調製4を避ける方法として、松島法が導入されました。この方法では、切り捨てられたピペットチップに殻を押した米カーネルを挿入する必要があります。先端はブロックトリマーによって静止し、薄い部分的な胚乳セクションは手持ち型のカミソリの刃を使用して収穫される。2016年に開発された別の迅速な技術は、チョーク品種10を含む多種多様な乾燥種子の薄い全体の切り分けを可能にしました。これらの方法は、ここで提示された迅速な技術の開発を動機づけました。
この新しい技術は、SEMを用いた胚乳フェノタイピングやデンプン形態解析のために、米核の断面をそのまま取得したい研究者に適しています。
このプロトコルは、松島切り捨てピペットチップ法4の適応を表し、いくつかの顕著な変更を伴います:(1)カーネルは、技術のどの時点でも浸透していません。(2)セクションを準備するためにブロックトリマーもウルトラミクロトームも必要としない。野生型の「半透明」品種(オリザ・サティバL.ssp. japonica cv. 日本バレ)と日本裸の変異体化された「チョーク状」ライン(ssg1、標準以下デンプングレイン1)4をこの研究で検討した。これらの2つの品種は、半透明とチョーク型の米のセクションの処理における技術的および視覚的な違いを実証するために、ここで分析のために選択されました。
ここで紹介する手法は、デスクトップ SEM の視覚化のための横断的な米の断面を準備するための、高速でシンプルで鋭いアプローチを表します。この断面化技術により、胚乳細胞の形状、大きさ、パターン、化合物顆粒、デンプン形態の迅速な観察が可能になります。胚精子のフェノタイピングや胚芽スクリーニングの目的のために、米カーネル4、23、24の全断面を得ることが重要である。メスの刃の圧力が粉々になったり粉々になったりするのを防ぐために、ピペットチップ内にカーネルを完全に挿入することが最も重要です。「望遠鏡」の集合体が適切に組み立て済みである限り、サンプルは、典型的な実験室の設定で既に手に入っている材料を使用して、15秒以内に可視化のために調製することができる(表2)。この技術は、楕円体の種子の断面に適用可能です 直径約4ミリメートルの最も広い点で.モデル草の種はブラキ表ディスタキオン(図S2A)も同様に切り離すことができますが、環状に囲まれたままにしないでください。小麦のような大きな種子は、容易に骨折し、断面化時に注意を必要とします(図S2B)。
ただし、ここで示す手法には、いくつかの制限があります。この技術を用いて得られたセクションは、光が通過するのに十分な薄さではなく、明視野(米カーネルセクション25の最大サンプル厚さ500 μm)や透過電子顕微鏡(TEM)(500 nm最大サンプル厚さ26)のような透過光ベースの顕微鏡アプローチに対して使用することを禁止する).また、断面「マトリックス」としてピペットチップを使用すると、この技術を使用して切り離すことができる種子のサイズも制限されます。米とは非常に異なる種に対してこの技術を適応させるためには、さらなるトラブルシューティングが必要であり、「マトリックス」のサイズは、購入可能なピペットチップのサイズによって制限されます。
この技術が提供するもう一つの明確な利点は、チョーク状の表現型の米のカーネルから作り出すことができるサンプルの質である。松島の研究でさえ、比較を目的として本研究で再現されたチョーク状表現型4の特定の方法を用いて断面を得ることは困難であると認めたことは注目に値する(図1S)。その場合、チョーク状の米サンプルを化学的に固定し、切り離し用の樹脂に埋め込む必要が生じるようになった。この新しい技術は、デスクトップSEMイメージングと組み合わせて、研究者が固定化サポートなしでより一貫性のある顕微鏡用の米カーネルの横断セクションを簡単に準備することを可能にする(表3)。
フェノミクスとメタボロミクスの新時代には、種子中のデンプンの機能と重要性をよりよく理解するために、変異原性線とトランスポゾンタグ付きライブラリを監視することが重要です。さらに、国際ライスジーンバンクは、130,000米のアクセスを27以上保持しています。ここで示したような迅速な種子のフェノタイピング技術は、栄養の質28のための分類とサンプリングを促進するだろう。最後に、この技術は、気候変動の影響を侵食することに照らして有用である可能性があります。穀物充填時の季節的な高温ストレスは、すでにチョークの主な原因として同定されていたが、最近の研究は、米収量7、29のチョーク性の増加に世界的な気温の上昇に関与している。このような迅速な胚乳型のフェノタイピングは、世界的な温度の上昇の影響の広範な農業イメージを提供するのに役立つかもしれない。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、フェノムProXデスクトップSEM機器の使用に関するシステムズ(SFR社)、およびマリア・ピラリノス(SFR社)とクロエ・ファン・ウーステンデ・トリプレット(オタワ大学医学部細胞生物学・画像取得コア施設)が提供する技術支援に感謝しています。資金は、オンタリオ州の経済開発、雇用創出、貿易省、タンパク質イージー社の政府から低炭素イノベーション基金(LCIF)によって提供されました。
JMP 15 | SAS | N/A | N/A |
Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100) | Agar Scientific | AGG3347N | N/A |
Phenom Pro Desktop SEM | Thermo Scientific | PHENOM-PRO | N/A |
Pipette Tips RC UNV 250 µL | Rainin | 17001116 | N/A |
SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium | Micro to Nano | 10-002012-50 | N/A |
Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm | Thermo Scientific | 3120019 | N/A |
Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm | Thermo Scientific | 28618256 | N/A |
Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle | Thermo Scientific | 5334 | N/A |
Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope | Zeiss | N/A | N/A |