이 프로토콜은 주사 전자 현미경 을 사용하여 내시경 및 전분 과립 형태의 분석을 위해 시리얼 씨앗 (예를 들어, 쌀)의 횡단 섹션의 준비를 허용합니다.
전분 과립 (SGs)은 식물 종, 특히 푸아세아 가족의 내정자에 따라 다른 형태를 나타낸다. 내정자 표현은 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 분석을 사용하여 SG 형태형에 기초하여 유전자형을 분류하는 데 사용할 수 있습니다. SGs는 커널(pericarp, aleurone 층 및 내정자)을 잘라내고 유기체 함량을 노출시킴으로써 SEM을 사용하여 시각화할 수 있습니다. 현재의 방법은 쌀 커널을 플라스틱 수지에 내장하고 마이크로톤또는 잘린 파이펫 팁에 내장되어 면도날을 사용하여 손으로 단면되어야 합니다. 이전 방법은 특수 장비를 필요로하고 시간이 많이 소요되는 반면, 후자는 쌀 유전자형에 따라 새로운 문제를 소개합니다. 백악질 쌀 품종, 특히, 그들의 내정자 조직의 friable 특성으로 인해 단면의이 유형에 대한 문제를 제기. 여기에 제시된 것은 피펫 팁과 메스 블레이드만 필요한 현미경 검사법을 위한 반투명 및 백악질 쌀 커널 섹션을 준비하는 기술입니다. 파이펫 팁의 경계 내에서 섹션을 준비하면 쌀 커널 내정자가 산산조각나는 것을 방지합니다 (반투명 또는 ‘유리체’ 표현형용) 및 무너져 (백악악표현형용). 이 기술을 사용하여, 내정자 세포 패터닝 및 손상되지 않은 SGs의 구조를 관찰할 수 있다.
전분 과립 (SGs)은 식물 종, 특히 푸아세아 가족의내정자1,2에따라 다른 형태를 나타낸다. 내정자 표현표는 스캐닝 전자 현미경 분석을 사용하여 SG 표현형에 기초하여 유전자형을 분류하는 데 사용될 수 있다. SGs는 커널을 잘라내고 내정자 세포벽2를멀리 캐고 서 스캔 전자 현미경 검사법 (SEM)을 사용하여 시각화 할 수 있습니다.
이 기술의 목적은 빠른 SEM 분석을 위해서만 횡단 쌀 커널 섹션을 쉽게 준비하는 것입니다. 이 기술의 개발은 최소한의 장비를 사용하여 시각화 직전에 시료가 SEM 현미경 검사법을 위해 준비되는 신속한 단면 분리 접근법의 필요성에 의해 동기를 부여받았습니다.
이 기술은 완전한 고정을 위해 파이펫 팁에 껍질 쌀 커널을 삽입하는 것을 포함한다. 이것은 특히 간면분면 백악질 쌀 커널 표현형, 이는 friable 쉽게 압력3에서무너질 수 있습니다. 분필은 커널의 모양에 영향을 미치고 커널을 연마하고 밀링 하는 동안 쉽게 부러지게 하기 때문에 쌀에서 바람직하지 않은품질입니다 3. 분악함은 육안으로 관찰할 수 있는 커널의 단면에 불투명한 영역으로 제시한다. 현미경 수준에서, 분필은 작고 느슨하게 포장 된 전분 과립이 특징입니다. 분악의 원인은유전적 4,5 또는 환경6,7일수 있다.
시리얼 종자 단면은 전통적으로 파라핀 왁스 또는 다른 고체 매트릭스4,8,9,10에포함 시료에 따라 화학 적 고정 방법 및 단면을 사용하여 제조되었습니다. 2010년에는 복잡하고 시간이 많이 소요되는 쌀 커널 시료 준비4를피하기 위한 방법으로 마쓰시마 방법이 도입되었다. 이 방법은 잘린 파이펫 팁에 껍질 쌀 커널의 삽입을 포함. 팁은 블록 트리머에 의해 고정되어 있으며, 얇고 부분적인 내정자 섹션은 휴대용 면도날을 사용하여 수확됩니다. 2016년에 개발된 또 다른 급속한 기술은백악악품종(10)을포함한 다양한 건조종의 얇은 전체 단면을 허용했다. 이러한 방법은 여기에 제시 된 빠른 기술의 개발을 동기를 부여.
이 새로운 기술은 SEM을 사용하여 내정자 phenotyping 및 전분 형태학 분석을 위한 쌀 커널의 그대로 횡단 단면을 얻고자 하는 연구자에게 적합합니다.
이 프로토콜은 마쓰시마 잘린 파이펫 팁 방법4의적응을 나타내며, 몇 가지 주목할 만한 수정 사항: (1) 커널은 기술의 어느 시점에서도 imbibed되지 않습니다. (2) 단면을 준비하기 위해 블록 트리머나 초미세토메가 필요하지 않습니다. 야생형 ‘반투명’품종(Oryza sativa L. ssp. japonbare cv. Nipponbare) 및 일본판베어의 돌연변이 ‘백악질’라인(ssg1, substandard 전분 곡물1)4가 이 연구에서 조사되었다. 이 두 품종은 반투명 및 백악악형 쌀 섹션 처리의 기술적, 시각적 차이를 보여주기 위해 여기에서 분석을 위해 선택되었다.
여기에 제시된 기술은 데스크톱 SEM 시각화를 위한 횡가 쌀 단면을 준비하는 데 있어 빠르고 간단하며 예리한 접근 방식을 나타냅니다. 이 단면 기술은 내정자 구조, 내정자 세포 모양, 크기 및 패턴, 화합물 과립 및 전분 형태의 신속한 관찰을 허용합니다. 내정자 페노티핑 및 세균 성 스크리닝의 목적을 위해, 쌀 커널4,23,24의전체 단면을 얻는 것이 중요하다. 메스 블레이드의 압력이 자궁 내정자를 강제로 무너지거나 산산조각내는 것을 방지하기 위해 파이펫 팁 내에 커널을 완전히 삽입하는 것이 가장 중요합니다. ‘망원경’ 조립이 제대로 구성되면, 샘플은 15초 이내에 시각화를 위해 제조될 수있다(표 2)일반적인 실험실 환경에서 이미 수작업으로 재료를 채용. 이 기술은 가장 넓은 지점에서 직경 약 4mm의 타원 성자의 단면화에 적용됩니다. 모델 잔디 의 씨앗 Brachypodium distachyon (도면 S2A)유사 하게 단면 될 수 있지만 무효 내에서 동봉 유지 하지 않습니다. 밀과 같은 큰 씨앗은 쉽게 골절하고 단면(그림 S2B)을할 때주의가 필요합니다.
그러나 여기에 제시된 기술에는 몇 가지 제한이 있습니다. 이 기술을 사용하여 얻은 단면은 밝은 필드(쌀커널 섹션25의최대 샘플 두께 500 μm) 및 투과 전자 현미경(TEM) (500 nm 최대 샘플 두께26)와 같은 전송광 기반 현미경 접근법에 대한 이 기술의 사용을 금지하는 빛이 통과하기에 충분히 얇지 않습니다. ). 피펫 팁을 ‘매트릭스’로 사용하면 이 기술을 사용하여 단면화할 수 있는 시드 크기도 제한됩니다. 쌀과 매우 유사한 종에 대해이 기술을 적응하기 위해 추가 문제 해결이 필요하며, ‘매트릭스’의 크기는 구매 가능한 파이펫 팁의 크기에 의해 제한됩니다.
이 기술이 제공하는 또 다른 뚜렷한 장점은 백악악형 쌀 커널에서 생성될 수 있는 샘플의 품질입니다. 마쓰시마 연구조차도 비교를 목적으로 본 연구에서 복제된 바와 같이, 백악악현상4에대한 특정 방법을 사용하여 단면을 얻기 어렵다는 것을 인정할 필요가있다(도 1S). 그들의 경우, 화학적으로 그들의 백악쌀 견본을 고치고 단면에 대한 수지에 포함시키는 것이 필요하게 되었습니다. 새로운 기술은 데스크톱 SEM 이미징과 함께, 연구원은 쉽게 고정 지원없이보다 더 일관성현미경 검사에 대한 쌀 커널의 횡단 섹션을 준비 할 수 있습니다(표 3).
현상전증과 메타볼로믹스의 새로운 시대에, 돌연변이 선과 트랜스포손 태그 라이브러리를 모니터링하여 씨앗에서 전분의 기능과 중요성을 더 잘 이해하는 것이 중요합니다. 또한, 국제 쌀 제네뱅크는 130 000 개 이상의 쌀 접근27을보유하고 있습니다. 여기에 제시 된 것과 같은 빠른 종자 phenotyping 기술은 영양 품질28에대한 분류 및 샘플링을 가속화 할 것이다. 마지막으로, 이 기술은 기후 변화 영향을 잠식하는 데 유용할 수 있습니다. 곡물 충진 중 계절고온 스트레스는 이미 분필6의주요 원인으로 확인되었지만, 최근 연구에 따르면 쌀 수확량7,29의분필 증가로 지구 온도가 상승하는 것을 암시하고 있습니다. 이러한 신속한 내정자 phenotyping은 지구 온도 상승의 효과의 광범위한 농업 이미지를 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 그들의 페넘 ProX 데스크탑 SEM 악기의 사용에 대한 연구 시스템 (SFR Corp.)뿐만 아니라 마리아 필라리노스 (연구 시스템 (SFR) 주식 회사)와 클로이 반 Oostende-Triplet (세포 생물학 및 이미지 수집 핵심 시설, 오타와 대학) 기금은 온타리오 경제 개발부, 일자리 창출 및 무역 부, 단백질 이지 코퍼레이션의 저탄소 혁신 기금 (국제재단)에 의해 제공되었습니다.
JMP 15 | SAS | N/A | N/A |
Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100) | Agar Scientific | AGG3347N | N/A |
Phenom Pro Desktop SEM | Thermo Scientific | PHENOM-PRO | N/A |
Pipette Tips RC UNV 250 µL | Rainin | 17001116 | N/A |
SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium | Micro to Nano | 10-002012-50 | N/A |
Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm | Thermo Scientific | 3120019 | N/A |
Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm | Thermo Scientific | 28618256 | N/A |
Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle | Thermo Scientific | 5334 | N/A |
Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope | Zeiss | N/A | N/A |