Dieses Protokoll ermöglicht die Herstellung von Querschnitten von Getreidesamen (z. B. Reis) zur Analyse der Endosperm- und Stärkegranulatmorphologie mittels Rasterelektronenmikroskopie.
Stärkegranulate (SGs) weisen je nach Pflanzenart unterschiedliche Morphologien auf, insbesondere im Endosperm der Familie der Poaceae. Die Endosperm-Phänotypisierung kann verwendet werden, um Genotypen basierend auf dem SG-Morphotyp unter Verwendung der rasterelektronenmikroskopischen (REM) Analyse zu klassifizieren. SGs können mit SEM visualisiert werden, indem man durch den Kern (Perikarp, Aleuronschichten und Endosperm) schneidet und den organellaren Inhalt freilegt. Aktuelle Methoden erfordern, dass der Reiskorn in Kunststoffharz eingebettet und mit einem Mikrotom oder in eine abgeschnittene Pipettenspitze eingebettet und von Hand mit einer Rasierklinge geschnitten wird. Die erste Methode erfordert spezielle Ausrüstung und ist zeitaufwendig, während die letztere je nach Reisgenotyp eine neue Vielzahl von Problemen mit sich bringt. Insbesondere Kalkreissorten stellen aufgrund der brüchigen Natur ihres Endospermgewebes ein Problem für diese Art der Schnitte dar. Hier wird eine Technik zur Vorbereitung von durchscheinenden und kalkhaltigen Reiskornschnitten für die Mikroskopie vorgestellt, die nur Pipettenspitzen und eine Skalpellklinge erfordern. Die Vorbereitung der Abschnitte innerhalb der Grenzen einer Pipettenspitze verhindert, dass das Reiskernendosperm zerbricht (für transluzente oder “glasartige” Phänotypen) und zerbröckelt (für kalkhaltige Phänotypen). Mit dieser Technik können Endospermzellmuster und die Struktur intakter SGs beobachtet werden.
Stärkegranulate (SGs) weisen je nach Pflanzenart unterschiedliche Morphologien auf, insbesondere im Endosperm der Poaceae-Familie 1,2. Die Endosperm-Phänotypisierung kann verwendet werden, um Genotypen basierend auf dem SG-Phänotyp unter Verwendung der rasterelektronenmikroskopischen Analyse zu klassifizieren. SGs können mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) visualisiert werden, indem der Kern geschnitten und die Endosperm-Zellwände abgehoben werden2.
Der Zweck dieser Technik besteht darin, quer verlaufende Reiskornabschnitte ausschließlich für die schnelle REM-Analyse einfach vorzubereiten. Die Entwicklung dieser Technik wurde durch die Notwendigkeit eines schnellen Querschnittsansatzes motiviert, bei dem Proben unmittelbar vor der Visualisierung mit minimaler Ausrüstung für die REM-Mikroskopie vorbereitet werden.
Diese Technik beinhaltet das Einführen des geschälten Reiskorns in die Pipettenspitze zur vollständigen Ruhigstellung. Dies ist besonders wichtig beim Querschnitt von kalkhaltigen Reiskorn-Phänotypen, die brüchig sind und unter Druck leicht zerbröckeln3. Kreide ist eine unerwünschte Eigenschaft bei Reis, da sie das Aussehen des Kerns beeinflusst und dazu führt, dass der Kern beim Polieren und Mahlen leichtbricht 3. Kreidegrad präsentiert sich als undurchsichtiger Bereich in einem Querschnitt des Kerns, der mit bloßem Auge beobachtet werden kann; auf mikroskopischer Ebene ist die Kreidezeit durch kleine, lose gepackte Stärkegranulate gekennzeichnet. Ursachen für Kreide können genetisch4,5 oder umweltbedingt6,7sein.
Getreidesaatgutquerschnitte wurden traditionell unter Verwendung chemischer Fixierungsmethoden und Schnitte nach dem Einbetten der Probe in Paraffinwachs oder eine andere feste Matrix4,8,9,10hergestellt . Im Jahr 2010 wurde die Matsushima-Methode eingeführt, um eine komplizierte und zeitaufwändige Vorbereitung von Reiskornproben zu vermeiden4. Diese Methode beinhaltete das Einführen des geschälten Reiskorns in eine abgeschnittene Pipettenspitze. Die Spitze wird von einem Blocktrimmer stationär gehalten, und dünne, partielle Endospermabschnitte werden mit einer Handrasierklinge geerntet. Eine weitere schnelle Technik, die 2016 entwickelt wurde, ermöglichte eine dünne Ganzschnitte einer Vielzahl von trockenen Samen, einschließlich kalkhaltiger Sorten10. Diese Methoden motivierten die Entwicklung der hier vorgestellten Schnelltechnik.
Diese neue Technik eignet sich für Forscher, die intakte Querquerschnitte von Reiskörnern für die Endosperm-Phänotypisierung und die Analyse der Stärkemorphologie mit REM erhalten möchten.
Dieses Protokoll stellt eine Anpassung der Matsushima-Pipettenspitzen-Methode4dar, mit mehreren bemerkenswerten Modifikationen: (1) Kerne werden an keiner Stelle der Technik aufgenommen; (2) Für die Vorbereitung der Abschnitte sind weder ein Blocktrimmer noch ein Ultramikrotom erforderlich. In dieser Studie wurden eine Wildtyp-‘transluzente’ Sorte(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare) und eine mutagene ‘kalkhaltige’ Linie von Nipponbare (ssg1, minderwertiges Stärkekorn1)4 untersucht. Diese beiden Sorten wurden für die Analyse hier ausgewählt, um die technischen und visuellen Unterschiede bei der Verarbeitung von transluzenten und kalkhaltigen Reisabschnitten zu demonstrieren.
Die hier vorgestellte Technik stellt einen schnellen, einfachen und scharfen Ansatz zur Vorbereitung von transversalen Reisquerschnitten für die Desktop-REM-Visualisierung dar. Diese Schnitttechnik ermöglicht die schnelle Beobachtung der Endospermstruktur, der Form, Größe und des Musters der Endospermzellen, des zusammengesetzten Granulats und der Stärkemorphologie. Für die Zwecke der Endosperm-Phänotypisierung und des Keimplasma-Screenings ist es entscheidend, einen ganzen Querschnitt des Reiskorns zu erhalten4,23,24. Es ist von größter Bedeutung, den Kern vollständig in die Pipettenspitze einzuführen, um zu verhindern, dass der Druck der Skalpellklinge das Endosperm zum Zerbröckeln oder Zerbrechen zwingt. Vorausgesetzt, die “Teleskop”-Assemblage ist ordnungsgemäß konstruiert, können Proben innerhalb von 15 Sekunden für die Visualisierung vorbereitet werden (Tabelle 2) unter Verwendung von Materialien, die bereits in einer typischen Laborumgebung zur Hand sind. Diese Technik ist auf den Querschnitt eines ellipsoidischen Samens mit einem Durchmesser von etwa vier Millimetern an seiner breitesten Stelle anwendbar. Samen des Modellgrases Brachypodium distachyon (Abbildung S2A) können ähnlich geschnitten werden, bleiben aber nicht im Ring eingeschlossen. Größere Samen, wie Weizen, brechen leicht und erfordern Pflege beim Schneiden (Abbildung S2B).
Es gibt jedoch mehrere Einschränkungen für die hier vorgestellte Technik. Schnitte, die mit dieser Technik erhalten werden, sind nicht dünn genug, damit das Licht hindurchgehen kann, was die Verwendung dieser Technik für durchgelassene mikroskopische Ansätze wie Hellfeld (500 μm maximale Probendicke für Reiskernabschnitte25)und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) (500 nm maximale Probendicke26) verbietet ). Die Verwendung einer Pipettenspitze als Schnittmatrix begrenzt auch die Größe des Saatguts, das mit dieser Technik geschnitten werden kann. Eine weitere Fehlerbehebung wäre erforderlich, um diese Technik für Arten anzupassen, die sich stark von Reis unterscheiden, und die Größe der “Matrix” ist durch die Größe der zum Kauf verfügbaren Pipettenspitzen begrenzt.
Ein weiterer entscheidender Vorteil, den diese Technik bietet, ist die Qualität der Proben, die aus kalkhaltigen Phänotyp-Reiskörnern hergestellt werden können. Es ist erwähnenswert, dass selbst die Matsushima-Studie zugab, dass es schwierig war, Querschnitte mit dieser speziellen Methode für kalkhaltige Phänotypen4zu erhalten, wie in dieser Studie zum Zwecke des Vergleichs repliziert (Abbildung 1S). In ihrem Fall wurde es notwendig, ihre kalkhaltigen Reisproben chemisch zu fixieren und sie zum Schneiden in Harz einzubetten. Die neue Technik in Verbindung mit der Desktop-REM-Bildgebung ermöglicht es dem Forscher, Querschnitte von Reiskörnern für die Mikroskopie mit mehr Konsistenz als ohne Immobilisierungsunterstützung einfach vorzubereiten (Tabelle 3).
In der neuen Ära der Phänomie und Metabolomik ist es wichtig, mutagene Linien und Transposon-markierte Bibliotheken zu überwachen, um die Funktion und Bedeutung von Stärke in Samen besser zu verstehen. Darüber hinaus hält die Internationale Reis-Genbank über 130 000 Reis-Beitritte27. Eine schnelle Samenphänotypisierungstechnik wie die hier vorgestellte würde die Klassifizierung und Probenahme für die Ernährungsqualität beschleunigen28. Schließlich kann diese Technik angesichts der sich ausbreitenden Auswirkungen des Klimawandels nützlich sein. Saisonaler Hochtemperaturstress während der Getreidefüllung wurde bereits als Hauptursache für Kalkablagerungen identifiziert6, aber neuere Studien haben steigende globale Temperaturen mit zunehmender Kreidehärte der Reiserträge in Verbindung gebracht7,29. Eine solche beschleunigte Endosperm-Phänotypisierung kann dazu beitragen, ein breites landwirtschaftliches Bild der Auswirkungen steigender globaler Temperaturen zu erhalten.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken Systems for Research (SFR Corp.) für den Einsatz ihres Phenom ProX Desktop SEM-Instruments sowie für die technische Unterstützung durch Maria Pilarinos (Systems for Research (SFR) Corp.) und Chloë van Oostende-Triplet (Cell Biology and Image Acquisition Core Facility, Faculty of Medicine, University of Ottawa). Die Finanzierung erfolgte durch den Low Carbon Innovation Fund (LCIF) des Ministeriums für wirtschaftliche Entwicklung, Schaffung von Arbeitsplätzen und Handel der Regierung von Ontario sowie von Proteins Easy Corp.
JMP 15 | SAS | N/A | N/A |
Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100) | Agar Scientific | AGG3347N | N/A |
Phenom Pro Desktop SEM | Thermo Scientific | PHENOM-PRO | N/A |
Pipette Tips RC UNV 250 µL | Rainin | 17001116 | N/A |
SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium | Micro to Nano | 10-002012-50 | N/A |
Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm | Thermo Scientific | 3120019 | N/A |
Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm | Thermo Scientific | 28618256 | N/A |
Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle | Thermo Scientific | 5334 | N/A |
Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope | Zeiss | N/A | N/A |