Этот протокол позволяет готовить поперечные срезы семян зерновых культур (например, риса) для анализа морфологии эндосперма и гранул крахмала с помощью сканирующей электронной микроскопии.
Гранулы крахмала (SGs) демонстрируют различную морфологию в зависимости от вида растений, особенно в эндосперме семейства Poaceae. Фенотипирование эндосперма может быть использовано для классификации генотипов на основе морфотипа SG с использованием сканирующего электронно-микроскопического (SEM) анализа. SG можно визуализировать с помощью SEM путем нарезки ядра (околоплодниковые, алейроновые слои и эндосперм) и обнажения органеллярного содержимого. Современные методы требуют, чтобы рисовое ядро было встроено в пластиковую смолу и разрезано с использованием микротома или встроено в усеченный наконечник пипетки и разделено вручную с помощью лезвия бритвы. Первый метод требует специализированного оборудования и отнимает много времени, в то время как второй вводит новый набор проблем в зависимости от генотипа риса. Меловые сорта риса, в частности, представляют проблему для этого типа сечения из-за рыхлого характера их эндоспермальной ткани. Здесь представлена методика приготовления полупрозрачных и меловых зерен риса для микроскопии, требующая только кончиков пипетки и лезвия скальпеля. Подготовка срезов в пределах кончика пипетки предотвращает разрушение эндосперма рисового ядра (для полупрозрачных или «стекловидных» фенотипов) и крошку (для меловых фенотипов). Используя эту технику, можно наблюдать паттерн клеток эндосперма и структуру неповрежденных SG.
Гранулы крахмала (SGs) демонстрируют различную морфологию в зависимости от вида растений, особенно в эндосперме семейства Poaceae 1,2. Фенотипирование эндосперма может быть использовано для классификации генотипов на основе фенотипа SG с использованием сканирующего электронно-микроскопического анализа. SG можно визуализировать с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) путем разрезания ядра и удаления клеточных стенок эндосперма2.
Целью этого метода является легкая подготовка поперечных срезов рисовых зерен исключительно для быстрого анализа SEM. Развитие этой методики было мотивировано необходимостью быстрого подхода к поперечному сечению, при котором образцы подготавливаются для SEM-микроскопии непосредственно перед визуализацией с использованием минимального оборудования.
Этот метод включает в себя введение шелушащегося рисового ядра в кончик пипетки для полной иммобилизации. Это особенно важно при поперечном сечении меловых рисовых ядер фенотипов, которые рыхлые и легко крошатся под давлением3. Мел является нежелательным качеством риса, поскольку он влияет на внешний вид ядра и заставляет ядро легко ломаться во время полировки и измельчения3. Мел представляет собой непрозрачную область в поперечном сечении ядра, которую можно наблюдать невооруженным глазом; на микроскопическом уровне мел характеризуется мелкими, слабо упакованными гранулами крахмала. Причины мела могутбыть генетическими 4,5 или экологическими6,7.
Поперечные сечения семян зерновых традиционно готовились с использованием химических методов фиксации и секционирования после встраивания образца в парафиновый воск или другую твердую матрицу4,8,9,10. В 2010 году метод Мацусима был введен как способ избежать сложной и трудоемкой пробоподготовки рисовых зерен4. Этот метод включал введение шелушащегося рисового ядра в усеченный наконечник пипетки. Наконечник удерживается неподвижно блочным триммером, а тонкие, частичные участки эндосперма собираются с помощью ручного лезвия бритвы. Еще одна быстрая методика, разработанная в 2016 году, позволила тонкое целое секционирование широкого спектра сухих семян, включая меловые сорта10. Эти методы мотивировали развитие представленной здесь быстрой техники.
Этот новый метод подходит для исследователей, которые хотят получить неповрежденные поперечные сечения рисовых зерен для фенотипирования эндосперма и анализа морфологии крахмала с использованием SEM.
Настоящий протокол представляет собой адаптацию метода4усеченного наконечника пипетки Мацусима с несколькими заметными изменениями: (1) ядра не впитываются ни в одной точке метода; (2) Для подготовки секций не требуется ни блочного триммера, ни ультрамикротома. В этом исследовании были исследованы дикий тип «полупрозрачного» сорта(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare) и мутагенизированная «меловая» линия Nipponbare (ssg1, некачественное крахмальное зерно1)4. Эти два сорта были отобраны для анализа здесь, чтобы продемонстрировать технические и визуальные различия в обработке полупрозрачных и меловых рисовых секций.
Метод, представленный здесь, представляет собой быстрый, простой и острый подход к подготовке поперечных сечений риса для визуализации SEM на рабочем столе. Этот метод секционирования позволяет быстро наблюдать структуру эндосперма, форму, размер и рисунок клеток эндосперма, составные гранулы и морфологию крахмала. Для целей фенотипирования эндосперма и скрининга зародышевой плазмы критически важно получить целое поперечное сечение рисового ядра4,23,24. Крайне важно вставить ядро полностью в кончик пипетки, чтобы давление лезвия скальпеля не заставило эндосперм крошиться или разрушаться. При условии правильной конструкции «телескопа» образцы могут быть подготовлены для визуализации в течение 15 секунд(таблица 2)с использованием материалов, уже имеющихся в наличии в типичных лабораторных условиях. Этот метод применим к поперечному сечению любого эллипсоидального семени диаметром около четырех миллиметров в его самой широкой точке. Семена модельной травы Brachypodium distachyon (рисунок S2A)могут быть аналогичным образом разделены, но не остаются заключенными в пределах кольцевого кольца. Более крупные семена, такие как пшеница, легко ломаются и требуют ухода при секционировании(рисунок S2B).
Тем не менее, есть несколько ограничений для техники, представленной здесь. Участки, полученные с помощью этого метода, недостаточно тонкие для прохождения света, что запрещает использование этого метода для микроскопических подходов на основе пропускаемого света, таких как яркое поле (максимальная толщина образца 500 мкм для секций рисового ядра25)и просвечивающая электронная микроскопия (TEM) (максимальная толщина образца 500 нм26 ). Использование наконечника пипетки в качестве «матрицы» секционирования также ограничивает размер семян, которые могут быть разделены с помощью этой техники. Для адаптации этого метода для видов, сильно отличающихся от риса, потребуется дальнейшее устранение неполадок, а размер «матрицы» ограничен размером наконечников пипеток, доступных для покупки.
Еще одним явным преимуществом, которое обеспечивает этот метод, является качество образцов, которые могут быть получены из рисовых зерен мелового фенотипа. Стоит отметить, что даже исследование Мацусимы признало, что было трудно получить поперечные сечения с использованием этого конкретного метода для меловых фенотипов4,воспроизведенных в этом исследовании с целью сравнения(рисунок 1S). В их случае возникла необходимость химически закрепить их меловые образцы риса и встроить их в смолу для секционирования. Новая методика, в сочетании с настольной SEM-визуализацией, позволяет исследователю легко готовить поперечные срезы рисовых зерен для микроскопии с большей консистенцией, чем без поддержки иммобилизации(таблица 3).
В новую эру феномики и метаболомики важно контролировать мутагенизированные линии и библиотеки с транспозонными метками, чтобы лучше понять функцию и важность крахмала в семенах. Кроме того, Международный генный банк риса содержит более 130 000 рисовых присоединений27. Метод быстрого фенотипирования семян, подобный представленному здесь, ускорит классификацию и отбор проб для питательного качества28. Наконец, этот метод может быть полезен в свете посягательств на последствия изменения климата. Сезонный высокотемпературный стресс во время наполнения зерна уже был идентифицирован как основная причина мела6,но недавние исследования показали, что повышение глобальных температур связано с увеличением меловости риса7,29. Такое ускоренное фенотипирование эндосперма может помочь обеспечить широкое сельскохозяйственное представление о влиянии повышения глобальных температур.
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарны Systems for Research (SFR Corp.) за использование их настольного SEM-инструмента Phenom ProX, а также за техническую помощь, предоставленную Марией Пиларинос (Systems for Research (SFR) Corp.) и Хлоей ван Остенде-Триплет (Cell Biology and Image Acquisition Core Facility, медицинский факультет Университета Оттавы). Финансирование было предоставлено Фондом низкоуглеродных инноваций (LCIF) от Министерства экономического развития, создания рабочих мест и торговли правительства Онтарио и Proteins Easy Corp.
JMP 15 | SAS | N/A | N/A |
Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100) | Agar Scientific | AGG3347N | N/A |
Phenom Pro Desktop SEM | Thermo Scientific | PHENOM-PRO | N/A |
Pipette Tips RC UNV 250 µL | Rainin | 17001116 | N/A |
SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium | Micro to Nano | 10-002012-50 | N/A |
Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm | Thermo Scientific | 3120019 | N/A |
Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm | Thermo Scientific | 28618256 | N/A |
Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle | Thermo Scientific | 5334 | N/A |
Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope | Zeiss | N/A | N/A |