Denne protokol giver mulighed for fremstilling af tværgående dele af kornfrø (f.eks. ris) til analyse af endosperm og stivelsesgranulatmorfologi ved hjælp af scanningselektronmikroskopi.
Stivelsesgranulat (SGs) udviser forskellige morfologier afhængigt af plantearterne, især i poaceaefamiliens endoperm. Endosperm phenotyping kan bruges til at klassificere genotyper baseret på SG morphotype ved hjælp af scanning elektron mikroskopisk (SEM) analyse. SGs kan visualiseres ved hjælp af SEM ved at skære gennem kernen (pericarp, aleuron lag, og endosperm) og udsætte organellar indhold. De nuværende metoder kræver, at riskernen indlejres i plastharpiks og er opdelt ved hjælp af en mikrotom eller indlejret i en afkortet pipettespids og sektionsopdelt i hånden ved hjælp af et barberblad. Den tidligere metode kræver specialiseret udstyr og er tidskrævende, mens sidstnævnte introducerer en ny række problemer afhængigt af risgenotype. Især kalkholdige rissorter udgør et problem for denne type afdeling på grund af deres endopermvævs friable karakter. Præsenteret her er en teknik til fremstilling af gennemsigtige og kalkholdige riskernesektioner til mikroskopi, der kun kræver pipettespidser og et skalpelblad. Ved tilberedning af sektionerne inden for rammerne af en pipettespids forhindres riskernens endoperm i at splintre (til gennemsigtige eller glasagtige’ fænotyper) og smuldrende (for kalkholdige fænotyper). Ved hjælp af denne teknik kan endospermcellemønstre og strukturen af intaktegs observeres.
Stivelsesgranulat (SGs) udviser forskellige morfologier afhængigt af plantearterne, især i endosperm af Poaceae-familien 1,2. Endosperm phenotyping kan bruges til at klassificere genotyper baseret på SG fænotype ved hjælp af scanning elektron mikroskopisk analyse. SGs kan visualiseres ved hjælp af scanning elektronmikroskopi (SEM) ved at skære kernen og lirke væk endosperm cellevægge2.
Formålet med denne teknik er nemt at forberede tværgående riskernesektioner udelukkende til den hurtige SEM-analyse. Udviklingen af denne teknik var motiveret af nødvendigheden af en hurtig tværsnit tilgang, hvor prøver er forberedt til SEM mikroskopi umiddelbart før visualisering ved hjælp af minimalt udstyr.
Denne teknik indebærer indsættelse af afskallet riskerne i pipettenspidsen for fuldstændig immobilisering. Dette er især vigtigt, når krydsafsnittet kridtet riskerne fænotyper, som er friable og let smuldre under tryk3. Chalkiness er en uønsket kvalitet i ris, da det påvirker kernens udseende og får kernen til at bryde let under polering og fræsning3. Chalkiness præsenterer som et uigennemsigtigt område i et tværsnit af kernen, der kan observeres af det blotte øje; på mikroskopisk niveau er kridtighed karakteriseret ved små, løst pakket stivelsesgranulat. Årsager til kridthed kan væregenetiske 4,5 eller miljømæssige6,7.
Krydssnit af kornfrø er traditionelt blevet fremstillet ved hjælp af kemiske fastgørelsesmetoder og indsnit efter prøveindlejring i paraffinvoks eller en anden fast matrix4,8,9,10. I 2010 blev Matsushima-metoden introduceret som en måde at undgå kompliceret og tidskrævende riskerneprøvepræparat4. Denne metode indebar indsættelse af den afskallede riskerne i en afkortet pipettespids. Spidsen holdes stationær af en bloktrimmer, og tynde, delvise endosperm sektioner høstes ved hjælp af et håndholdt barberblad. En anden hurtig teknik udviklet i 2016 tillod tynd hele afsnit af en bred vifte af tørre frø, herunder kridtede sorter10. Disse metoder motiverede udviklingen af den hurtige teknik, der præsenteres her.
Denne nye teknik er velegnet til forskere, der ønsker at opnå intakte tværgående tværsnit af riskerner til endosperm phenotyping og stivelse morfologi analyse ved hjælp af SEM.
Denne protokol repræsenterer en tilpasning af Matsushima afkortet pipettespidsmetode4med flere bemærkelsesværdige ændringer: (1) kerner er ikke imbibed på noget tidspunkt i teknikken; (2) der kræves hverken en bloktrimmer eller en ultramikrotom for at forberede sektionerne. En vild type »gennemsigtig« kultivar(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare) og en mutageniseret »chalky« linje af Nipponbare (ssg1, substandard stivelseskorn1)4 blev undersøgt i denne undersøgelse. Disse to sorter blev udvalgt til analysen her for at demonstrere de tekniske og visuelle forskelle i forarbejdningen gennemskinnelige og kridtagtige ris sektioner.
Den teknik, der præsenteres her repræsenterer en hurtig, enkel og ivrig tilgang til at forberede tværgående ris tværsnit til desktop SEM visualisering. Denne sektionsteknik giver mulighed for hurtig observation af endosperm struktur, endosperm celle form, størrelse og mønster, sammensatte granulater, og stivelse morfologi. Med henblik på endosperm phenotyping og germplasm screening, er det afgørende at opnå et helt tværsnit af riskernen4,23,24. Det er altafgørende at indsætte kernen helt i pipettespidsen for at forhindre, at skalpelbladets tryk tvinger endospermen til at smuldre eller splintre. Forudsat at ‘teleskopet’ assemblage er korrekt konstrueret, kan prøverne fremstilles til visualisering inden for 15 sekunder (tabel 2) med materialer, der allerede er i hånden i en typisk laboratorieindstilling. Denne teknik gælder for tværsnit af ellipsoide frø ca. fire millimeter i diameter på det bredeste punkt. Frø af modelgræs Brachypodium distachyon (Figur S2A) kan ligeledes adskilles, men forbliver ikke omgivet af annulus. Større frø, som hvede, fraktur let og kræver pleje ved indsnit (Figur S2B).
Der er dog flere begrænsninger for den teknik, der præsenteres her. Sektioner, der er fremstillet ved hjælp af denne teknik, er ikke tynde nok til, at lyset kan passere igennem, hvilket forbyder anvendelse af denne teknik til transmitterede lysbaserede mikroskopiske tilgange som lyst felt (500 μm maksimal prøvetykkelse for riskernesektioner25) og transmissionselektronmikroskopi (TEM) (500 nm maksimal prøvetykkelse26 ). Brugen af en pipettespids som afsnittet ‘matrix’ begrænser også størrelsen af frø, der kansektiones ved hjælp af denne teknik. Yderligere fejlfinding ville være nødvendig for at tilpasse denne teknik til arter, der er meget forskellige fra ris, og størrelsen af ‘matrixen’ er begrænset af størrelsen af pipettespidser, der kan købes.
En anden klar fordel, at denne teknik giver, er kvaliteten af prøver, der kan fremstilles af kalkholdige fænotype riskerner. Det er værd at bemærke, at selv Matsushima-undersøgelsen indrømmede, at det var vanskeligt at opnå tværsnit ved hjælp af denne særlige metode til kridtede fænotyper4, som replikeret i denne undersøgelse med henblik på sammenligning (Figur 1S). I deres tilfælde blev det nødvendigt at kemisk fastsætte deres kalkholdige risprøver og indlejre dem i harpiks til sektion. Den nye teknik, i forbindelse med desktop SEM imaging, gør det muligt for forskeren nemt at forberede tværgående dele af riskerner til mikroskopi med mere konsistens end uden immobilisering støtte (Tabel 3).
I den nye æra af fanomics og metabolomics er det vigtigt at overvåge mutageniserede linjer og transposon-tagged biblioteker for bedre at forstå funktionen og betydningen af stivelse i frø. Derudover har Den Internationale Ris Genebank over 130 000 ristiltrædelse27. En hurtig frø phenotyping teknik som den, der præsenteres her ville fremskynde klassificering og prøveudtagning for ernæringsmæssig kvalitet28. Endelig kan denne teknik være nyttig i lyset af de indgribende klimaændringer virkninger. Sæsonbetinget højtemperaturbelastning under kornfyldning var allerede blevet identificeret som en væsentlig årsag til kridthed6, men nylige undersøgelser har impliceret stigende globale temperaturer i at øge kridtheden af risudbyttet7,29. Sådanne fremskyndede endosperm phenotyping kan bidrage til at give et bredt landbrugsbillede af effekten af stigende globale temperaturer.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er taknemmelige for Systems for Research (SFR Corp.) for brug af deres Phenom ProX Desktop SEM instrument, samt for den tekniske bistand fra Maria Pilarinos (Systems for Research (SFR) Corp.) og Chloë van Oostende-Triplet (Cell Biology and Image Acquisition Core Facility, Faculty of Medicine, University of Ottawa). Finansiering blev ydet af Low Carbon Innovation Fund (LCIF) fra regeringen i Ontario’s Ministeriet for Økonomisk Udvikling, Jobskabelse og Handel, og Proteiner Easy Corp.
JMP 15 | SAS | N/A | N/A |
Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100) | Agar Scientific | AGG3347N | N/A |
Phenom Pro Desktop SEM | Thermo Scientific | PHENOM-PRO | N/A |
Pipette Tips RC UNV 250 µL | Rainin | 17001116 | N/A |
SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium | Micro to Nano | 10-002012-50 | N/A |
Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm | Thermo Scientific | 3120019 | N/A |
Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm | Thermo Scientific | 28618256 | N/A |
Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle | Thermo Scientific | 5334 | N/A |
Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope | Zeiss | N/A | N/A |