Denne protokollen gjør det mulig å utarbeide tverrgående deler av kornfrø (f.eks. ris) for analyse av endosperm og stivelsesgranulatmorfologi ved hjelp av skanning elektronmikroskopi.
Stivelsesgranulat (SGs) viser forskjellige morfologier avhengig av plantearter, spesielt i endospermen til Poaceae-familien. Endosperm fenotyping kan brukes til å klassifisere genotyper basert på SG morphotype ved hjelp av skanning elektron mikroskopisk (SEM) analyse. SGs kan visualiseres ved hjelp av SEM ved å kutte gjennom kjernen (pericarp, aleurone lag, og endosperm) og utsette organellarinnholdet. Strømmetoder krever at riskjernen bygges inn i plastharpiks og seksjoneres ved hjelp av en mikrotom eller innebygd i en avkortet pipettespiss og seksjoneres for hånd ved hjelp av et barberblad. Den tidligere metoden krever spesialisert utstyr og er tidkrevende, mens sistnevnte introduserer en ny rekke problemer avhengig av risgenotype. Chalky ris varianter, spesielt, utgjør et problem for denne typen seksjonering på grunn av friable naturen av deres endosperm vev. Presentert her er en teknikk for å forberede gjennomsiktige og krittaktig riskjerne seksjoner for mikroskopi, som bare krever pipettespisser og et skalpellblad. Forberedelse av seksjonene innenfor rammene av en pipettespiss forhindrer riskjerne-endospermen i å knuse (for gjennomsiktige eller “glasslegeme” fenotyper) og smuldrer (for krittaktige fenotyper). Ved hjelp av denne teknikken kan endosperm cellemønster og strukturen av intakte SGs observeres.
Stivelsesgranulat (SGs) viser forskjellige morfologier avhengig av plantearter, spesielt i endospermen til Poaceae-familien 1,2. Endosperm fenotyping kan brukes til å klassifisere genotyper basert på SG fenotype ved hjelp av skanning elektron mikroskopisk analyse. SGs kan visualiseres ved hjelp av skanning elektronmikroskopi (SEM) ved å kutte kjernen og lirke bort endospermcelleveggene2.
Formålet med denne teknikken er å enkelt forberede tverrgående riskjerneseksjoner utelukkende for den raske SEM-analysen. Utviklingen av denne teknikken var motivert av nødvendigheten av en rask tverrsnittstilnærming der prøver er forberedt på SEM-mikroskopi umiddelbart før visualisering ved hjelp av minimalt utstyr.
Denne teknikken innebærer innsetting av den huskede riskjernen i pipettespissen for fullstendig immobilisering. Dette er spesielt viktig når tverrsnitt av kritt riskjernefenotyper, som er sprø og lett smuldrer under trykk3. Chalkiness er en uønsket kvalitet i ris siden det påvirker utseendet til kjernen og får kjernen til å bryte lett under polering og fresing3. Chalkiness presenterer som et ugjennomsiktig område i et tverrsnitt av kjernen som kan observeres av det blotte øye; På mikroskopisk nivå er kalkhet preget av små, løst pakkede stivelsesgranulat. Årsaker til kritt kan være genetisk4,5 eller miljømessig6,7.
Kornfrø tverrsnitt har tradisjonelt blitt utarbeidet ved hjelp av kjemiske festemetoder og seksjonering etter prøveinnbygging i parafinvoks eller en annen solid matrise4,8,9,10. I 2010 ble Matsushima-metoden introdusert som en måte å unngå komplisert og tidkrevende riskjerneprøveforberedelse4. Denne metoden involverte innsetting av den huskede riskjernen i en avkortet pipettespiss. Spissen holdes stasjonær av en blokktrimmer, og tynne, delvise endosperm-seksjoner høstes ved hjelp av et håndholdt barberblad. En annen rask teknikk utviklet i 2016 tillot tynn hel seksjonering av et bredt utvalg av tørre frø, inkludert krittaktige varianter10. Disse metodene motiverte utviklingen av den raske teknikken som presenteres her.
Denne nye teknikken passer for forskere som ønsker å oppnå intakte tverrsnitt av riskjerner for endosperm fenotyping og stivelsesmorfologianalyse ved hjelp av SEM.
Denne protokollen representerer en tilpasning av Matsushima avkortet pipettespissmetode4, med flere bemerkelsesverdige modifikasjoner: (1) kjerner er ikke imbibed på noe tidspunkt i teknikken; (2) verken en blokktrimmer eller en ultramikrotomi er nødvendig for å forberede seksjonene. En vill type ‘gjennomsiktig’ cultivar (Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare) og en mutagenisert ‘chalky’ linje av Nipponbare (ssg1, substandard stivelse korn1)4 ble undersøkt i denne studien. Disse to kultivarer ble valgt ut til analysen her for å demonstrere de tekniske og visuelle forskjellene i behandling av gjennomsiktige og kalkaktige risseksjoner.
Teknikken som presenteres her representerer en rask, enkel og ivrig tilnærming til å forberede tverrgående ris tverrsnitt for desktop SEM-visualisering. Denne seksjoneringsteknikken muliggjør rask observasjon av endospermstruktur, endospermcelleform, størrelse og mønster, sammensatte granulater og stivelsesmorfologi. For endosperm fenotyping og bakterieplasma screening, er det viktig å oppnå et helt tverrsnitt av riskjernen4,23,24. Det er viktig å sette kjernen helt inn i pipettespissen for å forhindre at trykket på skalpellbladet tvinger endospermen til å smuldre eller knuse. Forutsatt at “teleskop” -monteringen er riktig konstruert, kan prøver klargjøres for visualisering innen 15 sekunder (tabell 2) ved hjelp av materialer som allerede er i hånden i en typisk laboratorieinnstilling. Denne teknikken gjelder for tverrsnitt av ethvert ellipformet frø omtrent fire millimeter i diameter på det bredeste punktet. Frø av modellgresset Brachypodium distachyon (Figur S2A) kan også deles, men forblir ikke omsluttet av annulus. Større frø, som hvete, brudd lett og krever forsiktighet ved seksjonering (Figur S2B).
Det er imidlertid flere begrensninger i teknikken som presenteres her. Seksjoner oppnådd ved hjelp av denne teknikken er ikke tynne nok til at lyset kan passere gjennom, noe som forbyr bruk av denne teknikken for overførte lysbaserte mikroskopiske tilnærminger som lyst felt (500 μm maksimal prøvetykkelse for riskjerneseksjoner25) og overføringselektronmikroskopi (TEM) (500 nm maksimal prøvetykkelse26) ). Bruken av en pipettespiss som seksjoneringsmatrise begrenser også størrelsen på frø som kan deles ved hjelp av denne teknikken. Ytterligere feilsøking vil være nødvendig for å tilpasse denne teknikken for arter som er svært forskjellige fra ris, og størrelsen på “matrisen” er begrenset av størrelsen på pipettespissene som er tilgjengelige for kjøp.
En annen tydelig fordel som denne teknikken gir er kvaliteten på prøver som kan produseres fra krittaktig fenotype riskjerner. Det er verdt å merke seg at selv Matsushima-studien innrømmet at det var vanskelig å få tverrsnitt ved hjelp av den spesielle metoden for krittaktige fenotyper4, som replikert i denne studien med det formål å sammenligne (Figur 1S). I deres tilfelle ble det nødvendig å kjemisk fikse sine kalkaktige risprøver og legge dem inn i harpiks for seksjonering. Den nye teknikken, sammen med desktop SEM-avbildning, gjør at forskeren enkelt kan tilberede tverrgående deler av riskjerner for mikroskopi med mer konsistens enn uten immobiliseringsstøtte (Tabell 3).
I den nye epoken med fenomener og metabolomikk er det viktig å overvåke mutageniserte linjer og transposonmerkede biblioteker for bedre å forstå funksjonen og betydningen av stivelse i frø. I tillegg har International Rice Genebank over 130 000 ristilganger27. En rask frø fenotyping teknikk som den som presenteres her ville fremskynde klassifisering og prøvetaking for ernæringsmessig kvalitet28. Til slutt kan denne teknikken være nyttig i lys av inngripende klimaendringer. Sesongmessig høytemperatur stress under kornfylling hadde allerede blitt identifisert som en viktig årsak til kritt6, men nyere studier har implisert stigende globale temperaturer i økende kalk av ris gir7,29. Slike fremskyndede endosperm fenotyping kan bidra til å gi et bredt landbruksbilde av effekten av økende globale temperaturer.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er takknemlige til Systems for Research (SFR Corp.) for bruk av deres Phenom ProX Desktop SEM-instrument, samt for teknisk assistanse levert av Maria Pilarinos (Systems for Research (SFR) Corp.) og Chloë van Oostende-Triplet (Cell Biology and Image Acquisition Core Facility, Fakultet for medisin, Universitetet i Ottawa). Finansieringen ble gitt av Low Carbon Innovation Fund (LCIF) fra regjeringen i Ontarios departement for økonomisk utvikling, jobbskaping og handel, og Proteins Easy Corp.
JMP 15 | SAS | N/A | N/A |
Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100) | Agar Scientific | AGG3347N | N/A |
Phenom Pro Desktop SEM | Thermo Scientific | PHENOM-PRO | N/A |
Pipette Tips RC UNV 250 µL | Rainin | 17001116 | N/A |
SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium | Micro to Nano | 10-002012-50 | N/A |
Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm | Thermo Scientific | 3120019 | N/A |
Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm | Thermo Scientific | 28618256 | N/A |
Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle | Thermo Scientific | 5334 | N/A |
Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope | Zeiss | N/A | N/A |