Detta protokoll gör det möjligt att förbereda tvärgående delar av spannmålsfrön (t.ex. ris) för analys av endoskopi och stärkelsegranulatmorfologi med hjälp av scanningelektronmikroskopi.
Stärkelsegranulat (SGs) uppvisar olika morfologier beroende på växtarten, särskilt i poaceaefamiljens endosperm. Endosperm fenotypning kan användas för att klassificera genotyper baserat på SG morphotype med hjälp av scanning elektron mikroskopisk (SEM) analys. SGs kan visualiseras med SEM genom att skära genom kärnan (pericarp, aleurone lager och endosperm) och exponera organellar innehållet. Nuvarande metoder kräver att riskorn är inbäddad i plastharts och sektionerad med en mikrotom eller inbäddad i en trunkerad pipettspets och sektionerad för hand med hjälp av ett rakblad. Den tidigare metoden kräver specialiserad utrustning och är tidskrävande, medan den senare introducerar en ny mängd problem beroende på risgenotyp. Kritiga rissorter utgör särskilt ett problem för denna typ av sektionering på grund av den spröda karaktären hos deras frövita vävnad. Presenteras här är en teknik för att förbereda genomskinliga och kritiga riskärnsektioner för mikroskopi, som endast kräver pipettspetsar och ett skalpellblad. Genom att förbereda sektionerna inom ramen för en pipettspets förhindras att riskärnornas endosperm splittras (för genomskinliga eller “glasaktiga” fenotyper) och smulas sönder (för kritiga fenotyper). Med hjälp av denna teknik kan endosperm cell mönstrar och strukturen av intaktA SGs observeras.
Stärkelsegranulat uppvisar olika morfologier beroende på växtarten, särskilt i poaceaefamiljens endosperm1,2. Endosperm fenotypning kan användas för att klassificera genotyper baserat på SG fenotyp med hjälp av scanning elektron mikroskopisk analys. SGs kan visualiseras med hjälp av scanningelektronmikroskopi (SEM) genom att skära kärnan och bända bort frövita cellväggarna2.
Syftet med denna teknik är att enkelt förbereda tvärgående riskärnsektioner enbart för den snabba SEM-analysen. Utvecklingen av denna teknik motiverades av behovet av en snabb tvärsnittsmetod där prover bereds för SEM-mikroskopi omedelbart före visualisering med minimal utrustning.
Denna teknik innebär införandet av den skalade riskärnan i pipettens spets för fullständig immobilisering. Detta är särskilt viktigt vid tvärsnitt av kritiga riskärnfenotyper, som är spröda och lätt smula under tryck3. Kritighet är en oönskad kvalitet i ris eftersom det påverkar kärnans utseende och gör att kärnan lätt bryts under polering ochfräsning 3. Kritighet presenteras som ett ogenomskinligt område i ett tvärsnitt av kärnan som kan observeras med blotta ögat; på mikroskopisk nivå kännetecknas kritigheten av små, löst packade stärkelsegranulat. Orsaker till kritighet kan vara genetiska4,5 eller miljö6,7.
Tvärsnitt av spannmålssäde har traditionellt beretts med hjälp av kemiska fastsättningsmetoder och sektionering efter provinbäddning i paraffinvax eller annan fast matris4,8,9,10. År 2010 introducerades Matsushima-metoden som ett sätt att undvika komplicerad och tidskrävande riskärnprovberedning4. Denna metod involverade införandet av den skalade riskärnan i en trunkerad pipettspets. Spetsen hålls stillastående av en blocktrimmer, och tunna, partiella endoskopisektioner skördas med ett handhållet rakblad. En annan snabb teknik som utvecklades 2016 möjliggjorde tunn hela sektionering av en mängd olika torra frön, inklusive kritiga sorter10. Dessa metoder motiverade utvecklingen av den snabba tekniken som presenteras här.
Denna nya teknik är lämplig för forskare som vill få intakta tvärgående tvärsnitt av riskärnor för endosperm fenotypning och stärkelsemorfologianalys med SEM.
Detta protokoll representerar en anpassning av Matsushima trunkerad pipettspetsmetod4, med flera anmärkningsvärda modifieringar: (1) kärnor är inte insupna vid någon tidpunkt i tekniken; (2) varken en blocktrimmer eller en ultramicrotom krävs för att förbereda sektionerna. En vild typ “genomskinlig” sort (Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare) och en mutageniserad “kritig” linje av Nipponbare (ssg1, undermålig stärkelsekorn1)4 undersöktes i denna studie. Dessa två sorter valdes ut för analysen här för att visa de tekniska och visuella skillnaderna i bearbetning av genomskinliga risavsnitt av och krittyp.
Tekniken som presenteras här representerar ett snabbt, enkelt och skarpt tillvägagångssätt för att förbereda tvärgående ris tvärsnitt för desktop SEM visualisering. Denna sektionsteknik möjliggör snabb observation av frövita struktur, endoskopi cell form, storlek och mönster, sammansatta granulat och stärkelse morfologi. Vid endospermfenotypning och screening av könsceller är det viktigt att erhålla ett helt tvärsnitt av riskorn4,23,24. Det är av största vikt att sätta in kärnan helt i pipettspetsen för att förhindra att trycket från skalpellbladet tvingar frövitan att smula eller splittras. Under förutsättning att “teleskopets” sammansättning är korrekt konstruerad kan proverna förberedas för visualisering inom 15 sekunder(tabell 2) med material som redan finns i en typisk laboratoriemiljö. Denna teknik är tillämplig på tvärsnitt av alla ellipsoidala frö cirka fyra millimeter i diameter vid dess bredaste punkt. Frön av modellgräset Brachypodium distachyon (Figur S2A) kan på samma sätt delas upp men förblir inte inneslutna i annulus. Större frön, som vete, spricker lätt och kräver vård vid sektionering (figur S2B).
Det finns dock flera begränsningar i tekniken som presenteras här. Sektioner som erhålls med denna teknik är inte tillräckligt tunna för att ljuset ska passera genom vilket förbjuder användning av denna teknik för överförda ljusbaserade mikroskopiska metoder som ljust fält (500 μm maximal provtjocklek för riskärnsektioner25) och transmissionselektronmikroskopi (TEM) (500 nm maximal provtjocklek26 ). Användningen av en pipettspets som sektionsmatris begränsar också storleken på utsädet som kan delas upp med denna teknik. Ytterligare felsökning skulle krävas för att anpassa denna teknik för arter som är mycket olikt ris, och storleken på “matrisen” begränsas av storleken på pipettspetsar som finns att köpa.
En annan tydlig fördel som denna teknik ger är kvaliteten på prover som kan produceras från kritiga fenotypriskärnor. Det är värt att notera att även Matsushima-studien medgav att det var svårt att få tvärsnitt med den specifika metoden för kritiga fenotyper4, som replikeras i denna studie för jämförelse (figur 1S). I deras fall blev det nödvändigt att kemiskt fixa sina kritiga risprover och bädda in dem i harts för sektionering. Den nya tekniken, i kombination med desktop SEM imaging, gör det möjligt för forskaren att enkelt förbereda tvärgående delar av riskärnor för mikroskopi med mer konsistens än utan immobiliseringsstöd (tabell 3).
I den nya eran av fenomen och metabolomik är det viktigt att övervaka mutageniserade linjer och transposonmärkta bibliotek för att bättre förstå stärkelsens funktion och betydelse i frön. Dessutom har Den internationella risgenbanken över 130 000 risanslutninger27. En snabb fröfenotypningsteknik som den som presenteras här skulle påskynda klassificering och provtagning för näringskvalitet28. Slutligen kan denna teknik vara användbar mot bakgrund av inkräktande klimatförändringseffekter. Säsongsbetonad högtemperaturstress under spannmålsfyllning hade redan identifierats som en viktig orsak till kritighet6, men nyligen genomförda studier har involverat stigande globala temperaturer i ökande kritighet hos risutbyten7,29. Sådan påskyndad endosperm fenotypning kan bidra till att ge en bred jordbruksbild av effekten av ökande globala temperaturer.
The authors have nothing to disclose.
Författarna är tacksamma för Systems for Research (SFR Corp.) för användning av deras Phenom ProX Desktop SEM-instrument, liksom för det tekniska stödet från Maria Pilarinos (Systems for Research (SFR) Corp.) och Chloë van Oostende-Triplet (Cell Biology and Image Acquisition Core Facility, Faculty of Medicine, University of Ottawa). Finansiering tillhandahölls av Low Carbon Innovation Fund (LCIF) från regeringen i Ontarios ministerium för ekonomisk utveckling, skapande och handel med arbetstillfällen och proteiner Easy Corp.
JMP 15 | SAS | N/A | N/A |
Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100) | Agar Scientific | AGG3347N | N/A |
Phenom Pro Desktop SEM | Thermo Scientific | PHENOM-PRO | N/A |
Pipette Tips RC UNV 250 µL | Rainin | 17001116 | N/A |
SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium | Micro to Nano | 10-002012-50 | N/A |
Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm | Thermo Scientific | 3120019 | N/A |
Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm | Thermo Scientific | 28618256 | N/A |
Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle | Thermo Scientific | 5334 | N/A |
Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope | Zeiss | N/A | N/A |