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Cancer Research

Bewertung des zellulären Zielengagements durch SHP2 (PTPN11) Phosphatase-Inhibitoren

Published: July 17, 2020 doi: 10.3791/61457
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Cancer Metabolism & Signaling Networks Program, NCI-Designated Cancer Center, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute

Summary

Die Fähigkeit, das Zielengagement von Kandidateninhibitoren in intakten Zellen zu bewerten, ist entscheidend für die Entdeckung von Arzneimitteln. Dieses Protokoll beschreibt einen 384 gut formatierten zellulären thermischen Schichttest, der zuverlässig die zelluläre Zielinteraktion von Inhibitoren erkennt, die entweder auf Den Wildtyp SHP2 oder seine onkogenen Varianten abzielen.

Abstract

Die vom PTPN11 Proto-Onkogen kodierte Src-Homologie 2 (SH2) ist ein wichtiger Vermittler der Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK)-gesteuerte Zellsignalisierung, die das Überleben und die Proliferation von Zellen fördert. Darüber hinaus wird SHP2 von Immun-Check-Point-Rezeptoren rekrutiert, um die Aktivierung von B- und T-Zellen zu hemmen. Aberrant SHP2 Funktion wurde in die Entwicklung, Progression, und Metastasierung vieler Krebsarten beteiligt. Tatsächlich sind kleine Molekül-SHP2-Inhibitoren kürzlich in klinische Studien zur Behandlung von soliden Tumoren mit Ras/Raf/ERK-Signalwegaktivierung eingetreten, einschließlich Tumoren mit einigen onkogenen Ras-Mutationen. Jedoch, die aktuelle Klasse der SHP2-Inhibitoren ist nicht wirksam gegen die SHP2 onkogene Varianten, die häufig bei Leukämien auftreten, und die Entwicklung von spezifischen kleinen Molekülen, die oncogenic SHP2 zielen, ist das Thema der aktuellen Forschung. Ein häufiges Problem mit den meisten Arzneimittel-Entdeckungskampagnen mit zytosolischen Proteinen wie SHP2 ist, dass die primären Assays, die chemische Entdeckung vorantreiben, oft In-vitro-Assays sind, die nicht über das zelluläre Zielengagement von Kandidatenverbindungen berichten. Um eine Plattform zur Messung des zellulären Zielengagements zu bieten, haben wir sowohl Wildtyp- als auch mutierte SHP2-Zell-Thermoschicht-Assays entwickelt. Diese Assays detektieren zuverlässig die Zielinteraktion von SHP2-Inhibitoren in Zellen. Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll dieses Assays zur Verfügung, das ein wertvolles Werkzeug für die Bewertung und Charakterisierung von SHP2-Inhibitoren darstellt.

Introduction

Tyrosin-Phosphorylierung spielt eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion in den Zellen1,2. Diese posttranslationale Modifikation wird durch Protein-Tyrosin-Kinasen (PTKs) katalysiert und durch Protein-Tyrosinphosphatasen (PTP) umgekehrt. Daher führt abnorme PTK- oder PTP-Funktion zu vielen vererbten oder erworbenen menschlichen Krankheiten3,4,5,6. Die Src-homology 2 (SH2) domänenhaltige Phosphatase 2 (SHP2) ist ein weit verbreiteter Nicht-Rezeptor-Typ PTP, der vom Proto-Onkogen PTP117 kodiert wird und ein wichtiger Regulator zahlreicher physiologischer Prozesse ist, die Signaltransduktion durch Aktivierung der Ras/Raf/ERK,PI3K/Akt oder JAK/STAT-Signalwege8beinhalten. Normalerweise ist die SHP2-Aktivität streng reguliert, um eine abnorme Signalisierung zu verhindern. Unter basalen Bedingungen wird SHP2 durch seine N-Terminal-DOMÄNE SH2 automatisch gehemmt, die den Zugriff auf den aktiven Standort innerhalb der katalytischen Phosphatase-Domäne blockiert (Abbildung 1A)9,10. Bei der Zellaktivierung rekrutieren Tyrosinphosphorylbindungsproteine SHP2, wodurch es seine aktive Konformation annimmt, bei der die aktive Stelle nun für ihre Substrate zugänglich ist. Bei vielen Krebsarten ist die SHP2-Aktivität erhöht. Somatische Gain-of-Function-Mutationen (GOF) in PTPN11 wurden hauptsächlich bei Leukämien identifiziert und verhindern die Bindung der N-SH2-Domäne an die Phosphatase-Domäne, was zu konstitutiv aktivem SHP2 (Abbildung 1B)11 führt. Germline GOF-Mutationen in PTPN11 sind verantwortlich für 50% der Fälle von Noonan-Syndrom, eine Entwicklungsstörung mit einem erhöhten Risiko für Malignität12. Bei soliden Tumoren, bei denen PTPN11-Mutationen selten sind, führen höhere Konzentrationen phosphorylierter Bindungsproteine zu einer verbesserten SHP2-Aktivität (Abbildung 1C). SHP2 ist auch wichtig für die Immun-Checkpoint-Signalisierung, da Checkpoint-Rezeptoren wie BTLA oder PD-1 SHP2 rekrutieren, um wichtige Signalmoleküle zu dephosphorisieren und die Aktivierung von Immunzellen zu verhindern13,14,15.

Die Ausrichtung von PTPs mit kleinen Molekülen war eine Herausforderung, da die aktive Stelle von PTPs hochkonserviert und hoch aufgeladen ist; Inhibitoren, die auf die aktive Stelle abzielen, sind oft potent, weisen jedoch eine schlechte Selektivität und orale Bioverfügbarkeitauf 16,17,18,19,20,21,22. Tatsächlich leiden viele berichtete SHP2-Hemmer an schlechter Selektivität und mangelnder Wirksamkeit in den Zellen23. Kürzlich wurden allosterische Inhibitoren von SHP2 mit guter Potenz und ausgezeichneter Selektivität berichtet (z. B. SHP09924 und RMC-455025) und haben erneutes Interesse an SHP2-Inhibitoren geweckt. Verbindungen auf Basis von SHP099 und RMC-4550 befinden sich derzeit in klinischen Phase-I-Studien zur Behandlung solider Tumoren mit Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK) Signalwegaktivierung26,27. Während wegweisend, Diese Verbindungen sind unwirksam gegen viele der SHP2 onkogene Erbmutanten, die Leukemogenese bei einer signifikanten Anzahl von Blutkrebspatienten28,29,30. Dieser Mangel an Potenz von SHP099-ähnlichen Verbindungen gegenüber den sHP2 onkogenen Varianten ergibt sich aus ihrem einzigartigen allosterischen Mechanismus, da sie die SHP2-Aktivität hemmen, indem sie die inaktive, geschlossene Konformation binden und stabilisieren, die in SHP2-Mutanten gestört wird. Darüber hinaus sind auf der Grundlage eines aktuellen Berichts31adaptive Resistenzmechanismen bei Patienten, die mit SHP099-ähnlichen Inhibitoren behandelt wurden, durchaus denkbar. Folglich ist die Entwicklung von SHP2-Inhibitoren der nächsten Generation, die auf ihren aktiven, offenen Zustand abzielen, Gegenstand intensiver Forschung.

Die Charakterisierung neuartiger SHP2-Inhibitoren in Zellen ist ein wesentlicher Aspekt des Lead-Optimierungsprozesses. Entscheidend ist, dass das bewährte Zielengagement des Inhibitors unter physiologischen Bedingungen ein zusätzliches Maß an Vertrauen dafür bietet, dass Ressourcen für die medizinische Chemie effizient auf Verbindungen mit vielversprechender zellulärer Wirksamkeit eingesetzt werden. In der Vergangenheit wurden mehrere Methoden zur Beurteilung der Bindung kleiner Molekülinhibitoren an ihre Targets entwickelt, vor allem für Proteinkianasen32. Um einen SHP2-Zellziel-Engagement-Assay zu entwickeln, haben wir einen zellulären thermischen Schichttest33verwendet. Dieser Assay, ähnlich wie der In-vitro-Thermoshift-Assay (PTS) für Proteine34, überwacht die thermische Stabilität des Zielproteins, die typischerweise durch die Bindung kleiner Moleküle verändert wird. Der ursprüngliche Assay ist ein Test mit niedrigem Durchsatz, der Antikörper nutzt, um den Zielproteinspiegel zu quantifizieren. Alternativ haben wir uns für eine kürzlich gemeldete Variante des thermischen Schicht-Assays entschieden, die eine β-Galactosidase-Enzymfragmentkomplementierung (EFC) verwendet (Abbildung 2)35. Für diese Experimente wird das Protein von Interesse in Zellen als N- oder C-terminales Fusionsprotein mit einem verbesserten ProLabel-Tag (ePL, einem 42-Aminosäure-Fragment von β-Galactosidase) ausgedrückt. Die Zellen werden dann auf 384-Well-PCR-kompatible Platten übertragen und mit verbindungen von Interesse inkubiert. Ein Thermocycler wird verwendet, um einen Temperaturgradienten auf die Zellen anzuwenden, deren Proteine denaturieren und aggregieren, wenn die Temperatur aufgrund ihrer thermischen Stabilität steigt. Die Fähigkeit einer Kandidatenverbindung, das Protein von Interesse zu binden und zu stabilisieren, führt zu einer erhöhten thermischen Stabilität dieses Proteins. Daher bleiben nach der Lyse der Zellen die getaggten Proteine, die durch eine Kandidatenverbindung stabilisiert wurden, bei höheren Temperaturen in Lösung als markierte Proteine von Zellen, die mit Fahrzeugkontrolle inkubiert werden. Reporter-Enzym-Akzeptor (EA) ist in der Lage, die löslichen ePL-markierten Proteine zu ergänzen, was zu einer nachweisbaren β-Galactosidase-Aktivität mit einem Lumineszenzsubstrat führt.

Wir haben vor kurzem einen robusten zellulären thermischen Schichttest für Wildtyp SHP2 (SHP2-WT) und eine häufige SHP2 onkogene Variante (SHP2-E76K) in einem miniaturisierten 384-Well-Format36entwickelt. Hier berichten wir über ein detailliertes Protokoll dieses Assays, das das Zielengagement von SHP2-Inhibitoren in Zellen zuverlässig erkennt und einen hohen Grad an Korrelation zwischen Inhibitor-Potenz und zellulären thermischen Schichtdaten aufzeigt. Der allgemeine Assay-Workflow ist in Abbildung 3dargestellt. Unsere Plattform verwendet N-terminalmarkierte ePL-SHP2-Fusionsproteine in voller Länge. Zur Erzeugung der entsprechenden pICP-ePL-N-SHP2-WT und pICP-ePL-N-SHP2-E76K Expressionsplasmide finden Sie in unserer aktuellen Publikation36. Dieser Test kann mit einem thermischen Gradienten durchgeführt werden, um SHP2-Thermoprofile zu erstellen und SHP2-Schmelztemperaturen in Gegenwart oder Abwesenheit von Inhibitoren zu bestimmen. Sobald thermische Profile erstellt wurden, kann es auch unter isothermen Bedingungen durchgeführt werden, so dass Inhibitor Dosis-Wirkungs-Bewertung. Beide Arten von Experimenten werden im Folgenden beschrieben.

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Protocol

1. Herstellung von Zellkultur und Reagenzien

  1. Formulieren Sie eine 500 ml Flasche Wachstumsmedien mit 10% fetalem Rinderserum, 1x Antibiotikum/Antimicotika, 20 mM HEPES und 1 mM Natriumpyruvat. Bei 4 °C lagern.
  2. Tauen Sie zelluläre thermische Schichtreagenzien (EA-Reagenz, Lysepuffer und Substrat) aus gefrorenen Original-Lagerflaschen.
  3. Reagenzien und Puffer als 2 ml Aliquots abgeben und bei -20 °C lagern.
    HINWEIS: Vermeiden Sie Einfrieren/Tauen für die Reproduzierbarkeit und verwenden Sie nur das Volumen des Reagenzes, das für das Assay-Verfahren erforderlich ist.

2. Wachstum und Wartung von HEK293T-Zellen

  1. Erhalten Sie niedrig durchgangshafte HEK293T-Zellen aus Kryospeicher.
  2. HEK293T-Zellen in Wachstumsmedien bei 37 °C, 5%CO2erhalten.
  3. Teilen Sie Zellen alle 4 Tage im Verhältnis 1:14.
    HINWEIS: Für eine optimale Leistung dürfen HEK293T-Zellen nicht mehr als 25 Mal durchgehen.

3. HEK293T Zellpräparat zur transienten Transfektion

  1. Trennen Sie HEK293T-Zellen von 16 ml-Platten mit 3 ml des Zellablösungsreagenz.
  2. Mit 12 ml Wachstumsmedien verdünnen. Sammeln Sie Zellen durch Zentrifugation bei 1.400 x g für 4 min.
  3. Setzen Sie das Pellet in 10 ml Wachstumsmedien wieder aus. Messen Sie die Konzentration und Lebensfähigkeit von Zellen mit Trypanblau und einem Zellzähler.
  4. Platte 7,0 x 105 exponentiell wachsende HEK293T-Zellen pro Brunnen in einer 6-Well-Zell-Kulturplatte ca. 24 h vor der Transfektion.
    HINWEIS: Reservieren Sie einen Brunnen für jedes Plasmid, das transfiziert werden soll.
  5. Inkubieren für 24 h bei 37 °C, 5%CO2.

4. Transfektion von HEK293T-Zellen

  1. Aus einem gereinigten Plasmidbestand aus pICP-ePL-N-SHP2-WT oder pICP-ePL-N-SHP2-E76K (ca. 200 ng/l) verdünnen Sie 2 g Plasmid-DNA in 200 l Transfektionspuffer.
  2. Wirbel für 10 s und Zentrifuge bei 1.400 x g für 4 min.
  3. Fügen Sie der verdünnten DNA 4 L Transfektionsreagenz hinzu. Wirbel für 10 s und Zentrifuge bei 1.400 x g für 4 min.
  4. Bei 23 °C für 10 min inkubieren.
  5. Entfernen Sie die 6 Well-Platten, die wachsende HEK293T-Zellen enthalten, aus dem Inkubator. Fügen Sie die Transfektionsmischung zu den angeschlossenen Zellen in der 6-Well-Platte hinzu. 24 h bei 37 °C, 5%CO2 inkubieren.

5. Vorbereitung von Assayplatten

  1. Bereiten Sie 10 mM Stofflösungen in DMSO von zu testenden Compounds vor.
  2. Dosieren Sie Inhibitorlösungen in eine 384-well Low-Low-Volume-Quellplatte für den sofortigen Gebrauch.
  3. Erkennen Sie das gewünschte Volumen von Inhibitoren oder Fahrzeugen (DMSO) mit einem Flüssigkeitshandler in 384-well-Echtzeit-PCR-Platten bei einem Zielendvolumen von weniger als 0,5% DMSO (v/v). Versiegeln Sie die Platte mit einem Plattenversiegeler mit Inertgasspülung.
    HINWEIS: Achten Sie bei Inhibitor-Dosis-Wirkungs-Assays darauf, DMSO entsprechend zu verschließen, so dass für jede Inhibitorkonzentration gleiche Mengen an DMSO verwendet werden. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, lagern Sie Platten bei 23 °C und verwenden Sie Platten innerhalb von 24 h.

6. Transfizierte Zellablösung und -zubereitung

  1. Vorinkubieren Sie Wachstumsmedien und Zellablösungsreagenz in einem 37 °C Wasserbad. Entfernen Sie transfizierte Zellen aus dem Inkubator. Behutsam Medien aus den Brunnen der Platte absaugen.
    HINWEIS: Verwenden Sie einen neuen Aspirator für jeden Brunnen, der ein anderes transfiziertes Plasmid enthält.
  2. 0,3 ml des Zellablösungsreagenz hinzufügen. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig hin und her, um die Oberfläche des Plattenbodens gründlich zu bedecken. Bei 23 °C für 2 min inkubieren.
  3. Fügen Sie 1 ml Wachstumsmedien zu jedem Brunnen hinzu. Sanfte Pipettenmedien und Zellen im Brunnen und auf ein 15 ml Falcon Zentrifugenrohr übertragen. Sammeln Sie Zellen durch Zentrifugation bei 1.400 x g für 4 min.
  4. Sanft, aber gründlich von den Medien absaugen.
    HINWEIS: Restphenolrot in der Zellablösung reagenz kann den Assay stören.
  5. Zellpellet in 2 ml Wachstumsmedien vorsichtig resuspendieren. Messen Sie die Konzentration und Lebensfähigkeit von Zellen mit Trypanblau und einem Zellzähler.
    HINWEIS: Die Zelllebensfähigkeit sollte > 90 % betragen, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
  6. Verdünnung der Zellen auf eine Konzentration von 125 Zellen/L. Zum Beispiel ist dies für einen 5-L-Test 625 Zellen/L. Für eine optimale Lebensfähigkeit halten Zellen in Suspension für nicht mehr als 2 h.

7. Inkubation von Zellen mit SHP2-Inhibitoren

  1. Geben Sie Zellen in einen sterilen Einkanal-Lösungstrog.
  2. Zentrifuge 384-well Echtzeit-PCR-Platte, die durch SHP2-Inhibitorabscheidung bei 2.500 x g für 5 min bei 23 °C vorgefertigt wurde.
  3. Entfernen Sie die Dichtung von der Verbundplatte. Fügen Sie mit einer Mehrkanal-Pipette von 125 L 5 l der verdünnten Zellen zu den gewünschten Brunnen hinzu.
  4. Zentrifugieren Sie die Platte bei 42 x g für 30 s ohne Deckel auf der Platte. Befestigen Sie eine Deckeldichtung an der Platte, nachdem die Platte nach unten gesponnen wurde, und bebrüten Sie die Assayplatte bei 37 °C, 5%CO2 für 1 h.

8. Herstellung von chemilumineszierenden Reagenz-Master-Mix

  1. Entfernen Sie die erforderliche Menge an Nachweisreagenzien (EA-Reagenz, Lysepuffer und Substrat) aus der Lagerung von -20 °C nach der Beschichtung von Zellen. Taureagenzien bei 23 °C.
    HINWEIS: Bereiten Sie aus Gründen der Übertragung ein Volumen vor, das das 1,5-fache des Gesamtvolumens der Zellen beträgt, die auf der Platte abgelagert wurden. Reagenzien nach Gebrauch nicht wiederverwenden.
  2. Bereiten Sie einen Master-Mix der Reagenzien unter Verwendung der Bedingung EA-10 vor, die aus Komponenten- und Volumenfraktion wie folgt besteht: EA-Reagenz (0,17), Lysepuffer (0,17), Substrat (0,67).
    HINWEIS: Die Reagenzienverhältnisse basieren auf Optimierungsexperimenten, die gemäß dem Lieferantenhandbuch durchgeführt werden.

9. Isotherm oder thermisches Profil Gradient Wärmeimpuls

  1. Programmieren Sie den gradientenfähigen Thermocycler für die Abgabe von Wärmeimpuls.
    1. Für thermische Profilgradientenexperimente programmieren Sie den Thermocycler mit den folgenden Beispielspezifikationen vor:
    2. Wärmeimpuls: 3 min gewünschte Schmelztemperatur (vertikaler oder horizontaler Gradient +/- 15 °C; Beispiel 38-68 °C verteilt auf 24 Brunnen ergibt Temperaturschritte von 1,25 °C).
  2. Ausgleichsrückgewinnungsschritt: 3 min 20 °C mit Rampengeschwindigkeit = 1 °C/s
    1. Für isotherme Experimente wird das Protokoll wie folgt eingerichtet:
    2. Wärmeimpuls: 3 min 55 °C. Ausgleichsrückgewinnungsschritt: 3 min 20 °C mit Rampengeschwindigkeit = 1°C/s
      HINWEIS: Für eine erhöhte Reproduzierbarkeit, da es schwierig sein kann, die Platte genau zu dem Zeitpunkt zu platzieren, wenn der Thermocycler die gewünschte Temperatur erreicht, richten Sie das Programm ein, um 15 s herunterzuzählen, bevor Sie den 3 min Puls beginnen. Für den Thermocycler, der in diesem Experiment verwendet wird, siehe Tabelle der Materialien,wird der Deckel während des Wärmeimpulses hochgehalten.

10. Lyse-Erkennung und -Messung

  1. Ergänzungs-Assayplatten mit Lyse-Erkennungs-Master-Mix durch Addition gleicher Volumina (5 l) zu jedem Bohrwert, der mit einer Mehrkanalpipette analysiert werden soll.
  2. Zentrifugieren Sie die Platte 42 x g für 30 s. Bei 23 °C in Dunkelheit 30-60 min lagern.
  3. Messen Sie die Chemilumineszenz mit einem Mikroplattenleser, der in der Lage ist, Lumineszenz im 384-Well-Format zu erkennen. Durchführen der Lumineszenzmessung mit dem optimierten Plattentyp und der Integrationszeit (Integrationszeit 1000 ms, Abrechnungszeit 0 s). Messen Sie Werte als Anzahl/s und Ausgabe für die weitere Analyse.

11. Datenanalyse

  1. Analysieren Sie die Lumineszenzdaten mit einer wissenschaftlichen 2D-Grafik- und Statistiksoftware.
  2. Generieren Sie thermische Profile, indem Sie die normalisierten Lumineszenzdaten (normalisiert zur Fahrzeugsteuerung) mit hilfe einer nichtlinearen Regression und einem Boltzmann-Sigmoidalmodell analysieren.
    HINWEIS: In thermischen Profilexperimenten definiert die berechnete V50, die Temperatur, die der Halbpunkt zwischen dem unteren und oberen Rand der Kurve ist, die Schmelztemperatur von SHP2. In isothermen Experimenten definiert EC50 die Konzentration des Inhibitors, der eine halbmaximale Reaktion gibt.

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Representative Results

Das thermische Gradientenexperiment für SHP2-WT führte zu einem sigmoidalen zellulären thermischen Profil mit einem schmalen Schmelzübergang, der typisch und konsistent für ein gefaltetes Protein ist (Abbildung 4A). SHP2 besteht aus drei unabhängigen Domänen: zwei SH2-Domänen und der katalytischen Domäne (Abbildung 1). In der automatisch hemmenden geschlossenen Konformation werden diese Domänen selbst assoziiert; der schmelzübergang, der im thermischen Profilexperiment beobachtet wurde, spiegelte diesen Zustand vermutlich in der Zelle wider. Die Inkubation von SHP2-WT mit dem allosterischen Inhibitor SHP099 bei 10 M stabilisierte das SHP2-WT-Thermoprofil in signifikantem und messbarem Maße (Abbildung 4A). Dies spiegelt den bekannten Bindungsmodus von SHP099-ähnlichen Inhibitoren wider, die als "molekularer Kleber"37 zwischen den regulatorischen Bindungs-SH2-Domänen und der katalytischen Untereinheit fungieren. Wichtig ist, dass unser zellulärer thermischer Schichttest bestätigte, dass SHP099 in die Zelle eindringen und an den markierten SHP2-WT binden kann. Die Stabilisierung von SHP2 verfolgt auch mit der Wirksamkeit von SHP099-ähnlichen allosterischen Verbindungen. Bei 10 m erzeugte der stärkere RMC-4550 (gemeldeter IC50 = 0,6 nM) einen höheren Stabilisierungsgrad als SHP099 (gemeldeter IC50 = 70 nM) für SHP2-WT (Abbildung 4B).

Wir beobachten ein anderes Verhalten im thermischen Profil des Zieleingriffsassays mit dem onkogenen Mutanten SHP2-E76K (Abbildung 4C). Das thermische Profil für SHP2-E76K hat einen weniger schmalen Schmelzübergang, der die Destabilisierung widerspiegelt, die die tertiäre Struktur von SHP2 durch die E76K-Mutation vermittelt, die bekanntermaßen Wechselwirkungen zwischen den SH2-Domänen und der katalytischen Untereinheit stört. Daher wurde die beobachtete Schmelztemperatur im Vergleich zum WT-Protein reduziert. Wichtig ist, dass bei der Inkubation mit dem allosterischen Inhibitor SHP099 bei 10 M nur eine marginale thermische Stabilisierung beobachtet wurde, die mit den bekannten Eigenschaften von SHP099 und ähnlichen Inhibitoren28,29,30übereinstimmte.

Der Expressionspegel des ePL-markierten Proteins, das untersucht werden soll, kann die Signalintensität dramatisch beeinflussen. Gezeigt (Abbildung 4D) sind thermische Profile für transiente und stabil integrierte SHP2-WT-Zellen unter identischen Assay-Bedingungen. Die Normalisierung dieser unterschiedlichen Kurven ermöglicht vergleichbare thermische Profile (Abbildung 4E), was auf die breite Palette des EFC-Erkennungssystems hinweist. Es ist wichtig zu beachten, dass wir sowohl transiente Transfektion als auch stabile Integration SHP2 verwendet haben, die Zellen mit vergleichbaren Ergebnissen exzessierst. Für die Erzeugung stabiler Zelllinien ist zu beachten, dass HEK293-Zellen anstelle von HEK293T-Zellen verwendet werden sollten, da HEK293T-Zellen bereits einen Neomycin-Resistenzmarker haben, der die Selektion von Zellen mit integriertem pICP-ePL-N-SHP2-Plasmid verhindern würde, das ein Neomycin/Kanamycin-Resistenzgen zur Selektion in Säugetierzellen enthält.

Um Inhibitor-Dosis-Wirkungs-Messungen zu erhalten, kann man zusammengesetzte Titrationen an Zellen unter isothermen Bedingungen durchführen. Dazu schlagen wir vor, zunächst das Temperaturoptimum für diese Messungen zu bestimmen. Unter Ausnutzung der Thermocycler-Fähigkeit, thermische Gradienten auf der "kurzen" Achse einer 384-Well-Platte zu erzeugen, kann eine Reihe von isothermen Titrationen auf einer einzigen Platte durchgeführt werden. Abbildung 5A zeigt repräsentative Ergebnisse dieser Optimierung für SHP2-WT mit einer begrenzten Fünf-Punkt-Dosis-Antwort von RMC-4550. Temperaturen, die zu niedrig waren, um das Protein zu denaturiert, erzeugten ein hohes Signal, das unabhängig von dem Medikament war. In ähnlicher Weise ermöglichten zu hohe Temperaturen der Verbindung wenig Kapazität, um das Protein zu stabilisieren. Bei einer optimalen Temperatur, wie durch dieses Experiment bestimmt, ergab eine isotherme Titration mit einer vollständigen 10-Punkt-Dosis-Antwort jedoch eine nützliche EC50 für RMC-4550(Abbildung 5B). Zusätzlich zu den hier gezeigten repräsentativen Daten haben wir festgestellt, dass Experimente unter optimierten isothermen Bedingungen eingesetzt werden können, um neuartige SHP2-Inhibitoren effizient auf ihre Fähigkeit zu untersuchen, Zellmembranen zu kreuzen und ihr Ziel in Zelleneinzubinden 36.

Figure 1
Abbildung 1: Regulierung der SHP2-Aktivität.
(A) Die SHP2-Aktivität ist in normalen Zellen streng reguliert. Unter basalen Bedingungen versperrt seine N-Terminal-SH2-Domäne den aktiven Standort innerhalb der Phosphatase-Domäne (PTP), was zu einer Autoinhibition führt. RTK-Wachstumsfaktor und Zytokinstimulation führt zu Tyrosin-Phosphorylierung von Adapterproteinen, die dann an die SH2-Domänen binden, was zu einer Konformationsänderung führt, wodurch die aktive SHP2-Site für ihre Substrate zugänglich wird. (B) Somatische SHP2-Mutationen, die häufig bei Leukämien auftreten, befinden sich an der Schnittstelle zwischen den N-SH2- und Phosphatase-Domänen und verhindern, dass SHP2 die geschlossene, autohemmte Konformation annimmt, was zu einer konstitutiv aktiven Phosphatase führt. (C) Bei soliden Tumoren führen Amplifikation oder Überexpression von Wachstumsfaktoren, RTKs oder Gerüstadaptern zu einer abwegigen Aktivierung von SHP2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: SHP2-Prinzipien für die zelluläre thermische Verschiebung.
Unser zellulärer Ziel-Engagement-Assay basiert auf einem β-Galactosidase (β-gal) Enzymfragmentkomplementierung (EFC) Assay. Zellen (HEK293T), die SHP2 in voller Länge mit einem ePL-Fusionstag (42 Aminosäurefragment von β-gal) exdrücken, werden mit einer Sondenverbindung behandelt und einem kurzen Wärmeimpuls ausgesetzt, der dazu führt, dass SHP2 denaturiert und unzugängliche unlösliche Aggregate bildet, wodurch das ePL-Tag unzugänglich wird. Die spezifische Bindung der Sondenverbindung an SHP2 kann ihre thermische Stabilität verbessern. Die thermische Stabilisierung bietet mit dem ePL-Tag ein löslicheres Zielprotein zur Komplementierung im Reporterenzym-Chemilumineszenzsystem. Aggregate führen zu einer reduzierten Komplementierung und Lumineszenz. Diese Zahl wurde ab Ref.36geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Miniaturisierter SHP2-Geräteworkflow.
Die routinemäßige Durchführung des Assays nutzt die angegebene Ausrüstung. Assayplatten werden mit einem akustischen Flüssigkeitshandler hergestellt, der Nanoliter-Mengen an Verbindungen liefert. Die Zellübertragung kann manuell mit einer Mehrkanalpipette oder mit einem automatischen Flüssigkeitsspender durchgeführt werden. Die Wärmepulsdenaturierung verwendet einen Thermocycler, der thermische Gradienten an eine 384-Well-Platte liefern kann. Ein Mikroplattenleser wird verwendet, um die β-gal EFC-Assay-Chemilumineszenz zu erkennen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Zelluläre Zielinteraktion allosterischer SHP2-Inhibitoren mit SHP2-WT- und SHP2-E76K-Proteinen.
(A) Das SHP2-WT-Protein in Gegenwart eines Fahrzeugs (DMSO, rot) erzeugte ein gut erzogenes zelluläres thermisches Profil mit einem schmalen Schmelzübergang, der mit einem gefalteten Protein im autohemmten Zustand übereinstimmt. Die Inkubation von SHP2-WT-exemitten Zellen mit 10 M SHP099 stabilisierte das Protein im gebundenen Zustand (blau). (B) ZelluläreS Target Engagement thermische Profile von SHP2-WT in Abwesenheit (rot) oder Vorhandensein des SHP099-ähnlichen allosterischen Inhibitors RMC-4550 (10 m, blau). RMC-4550 produzierte eine erhöhte zelluläre Stabilisierung von SHP2-WT als bei SHP099 beobachtet. Diese erhöhte Ziel-Engagement-Tracks mit seiner größeren biochemischen Potenz. (C) Der Mutant SHP2-E76K hatte eine weniger ausgeprägte Schmelzkurve, die mit einem Zustand übereinstimmte, der sich weitgehend in der "offenen" aktiven Form (rot) befindet. SHP099 erhöhte bei 10 M nur geringfügig die Schmelztemperatur SHP2-E76K (blau), die mit biochemischen Hemmungs- und zellulären Wirksamkeitsdaten in Verbindung steht. (D) Das beobachtete Chemilumineszenzsignal entspricht dem Expressionspegel von ePL-SHP2. Im Vergleich zu transfizierten HEK293T-Zellen hatten HEK293-Zellen, in denen die ePL-getaggten SHP2-WT stabil in das Genom integriert war, eine reduzierte ePL-SHP2-Expression. Folglich zeigten die rohen unnormalisierten Chemiluminesenz-Thermoprofile ein stark reduziertes Lumineszenzsignal für die stabil exszierenden HEK293-Zellen (blau) im Vergleich zu den transient transfizierten HEK293-Zellen (rot). E) Die Normalisierung der Rohchemilumineszenzdaten für stabile (HEK293) und transient transfizierte (HEK293T) erzeugte vergleichbare thermische Profile, die die Empfindlichkeit der Messungen zeigten. Datenpunkte und Fehlerbalken (±SD) stellen doppelte Messungen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Zelluläres Target Engagement isotherme Dosis-Wirkungs-Assay für SHP2-WT.
(A) Um optimale isotherme Bedingungen zur Beurteilung des dosisabhängigen Zielengagements von SHP2-Inhibitoren zu ermitteln, wird zunächst ein thermischer Gradient über die kurze Achse einer 384-Well-Platte durchgeführt. Dies ermöglicht eine effiziente Bewertung der Fünfpunkt-Dosis-Antworten von Inhibitoren (RMC-4550; 0,08–10 m), um die optimale Temperatur zu identifizieren. (B) Eine vollständige zelluläre isotherme Dosis-Wirkung (10-Punkt) für RMC-4550 bei einer optimalen Temperatur von 56°C. Die EC50 bei dieser Temperatur ist angegeben. Datenpunkte und Fehlerbalken (± SD) stellen Quadruplikate-Messungen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Wir haben einen Ziel-Engagement-Assay vorgestellt, der die direkte Bindung kleiner Moleküle an die SHP2-Phosphatase in Zellen bestätigen kann. Der Test kann zwischen niedrigen und hohen Affinitätshemmern unterscheiden und, was wichtig ist, einen Mangel an Wirksamkeit durch die allosterischen Inhibitoren des SHP099-Typs für die GOF onkogene SHP2-E76K Mutant bestätigen. Eine Stärke dieses miniaturisierten Assays ist seine Fähigkeit, in eine SHP2-Hemmer-Screening-Kampagne integriert zu werden. Die Fähigkeit des Assays, die intrazelluläre Bindung an SHP2 durch unbekannte chemische Stoffe zu bestätigen, ist eine wichtige Fähigkeit, um sicherzustellen, dass Screening-Ressourcen effizient eingesetzt werden können. Insgesamt ist das miniaturisierte Protokoll robust und zuverlässig.

Ein kritischer Aspekt des Assays ist das Timing; die besten Ergebnisse werden 24 h nach Transfektion der HEK293T-Zellen erzielt. Die SHP2-WT- und SHP2-E76K-Proteine scheinen nicht toxisch zu sein; Eine langfristige hohe Expression könnte jedoch die Empfindlichkeit des Experiments verringern und eine erneute Optimierung erfordern. Ein sorgfältiger Umgang mit Zellen, um sie zu lösen und auf den Assay vorzubereiten, ist eine zusätzliche kritische Überlegung. Standardmethoden für die Zellkultur reichen jedoch aus, um qualitativ hochwertige Daten zu erstellen. Aufgrund der geringen Mengen, die in diesem Test verwendet werden, haben wir eine Reihe von Zentrifugationsschritten in den Workflow integriert. Diese Schritte haben den Zweck, quantitative Seuchen zu gewährleisten, daher wird die Einhaltung der Beschleunigung und der Zeit der Zentrifugation empfohlen. Bemerkenswert ist, dass die Assay-Reagenzien nach schlechter Handhabung leiden können. Daher empfehlen wir, dass sie bis zur Verwendung aliquoted und eingefroren aufbewahrt werden.

Das am häufigsten auftretende Problem bei der Leistung dieses Assays ist ein unregelmäßiges (lautes) oder niedriges Lumineszenzsignal. Um die Ursache dieses Problems zu bestimmen, ist es Routine, Western Blot-Analyse an transfizierten HEK293T-Zellen mit Anti-ePL-Antikörpern durchzuführen, um eine zuverlässige Expressionsebene von SHP2-WT und SHP2-E76K zu gewährleisten. Mit dem in Schritt 4 beschriebenen Reagenzprotokoll haben wir die besten Ergebnisse erzielt. Sobald Transfektionsbedingungen festgelegt sind und ein einziger Bestand an SHP2-Expressionsplasmid erhalten ist, haben wir festgestellt, dass der Assay sehr zuverlässig ist.

Die Assay-Entwicklung erfordert eine Optimierung des chemilumineszierenden Signalfensters, um zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten. Zur Optimierung des Testfensters ist der wichtigste Parameter die Formulierung des Detektionsreagenz-Master-Mix, wie im Lieferantenhandbuch beschrieben. Diese Optimierung erfolgt durch systematische Änderung des EA-Reagenz-Substrat-Verhältnisses im Master-Mix, während die Lysepufferkomponente konstant gehalten wird (für diese Messung reichen in der Regel vier verschiedene Bedingungen aus). Als Hintergrund dient eine Bedingung mit Null-EA-Reagenz. Der Test wird wie oben beschrieben durchgeführt, und das Verhältnis des beobachteten Signals zum Hintergrund (S/B) wird berechnet. Zuverlässige Ergebnisse werden erzielt, wenn das S/B-Verhältnis >50 beträgt. Master-Mix-Bedingungen, die zu einem außergewöhnlich hohen Signal führen, sind zu vermeiden, da sie zu einer Erschöpfung des Chemilumineszenzsubstrats führen.

Eine mögliche Einschränkung des Assays ist seine Empfindlichkeit. Nach unserer Erfahrung sind Inhibitoren mit mindestens geringer mikromolarer Potenz in SHP2-Phosphatase-Inhibition-Assays erforderlich, um messbare Effekte im zellulären thermischen Schichttest zu erzeugen. Als allgemeine Richtlinie schlagen wir vor, zunächst Kandidatenverbindungen in In-vitro-PTS-Assays mit rekombinanter SHP236zu bewerten. Basierend auf den Ergebnissen unseres laufenden SHP2-Inhibitor-Erkennungsprogramms, eine Verbindungen Fähigkeit, die SHP2 Schmelztemperatur in vitro zu verschieben, verfolgt gut mit seiner Fähigkeit, das SHP2-Protein in Zellen zu stabilisieren (oder manchmal zu destabilisieren). Interessanterweise scheint die relative Stabilisierung von SHP2-WT durch SHP099-ähnliche allosterische Inhibitoren größer zu sein als die, die durch ebenso potente SHP2-aktive, standortgesteuerte Inhibitoren verursacht wird, was wahrscheinlich die Fähigkeit der allosterischen Inhibitoren widerspiegelt, eine physiologisch relevante Konformation des SHP2-WT-Proteins effektiv zu stabilisieren.

Neben der SHP2-Phosphatase haben wir Erfahrungen in der Entwicklung zellulärer Target-Engagement-Assays für andere Phosphatasen und Kiinasen gesammelt. Eine primäre Überlegung mit einem anderen Proteinziel besteht darin, eine Kombination von positiven und negativen Kontrollexperimenten zu nutzen, um die Gültigkeit des Assays festzustellen, bevor Ressourcen vollständig für die Interpretation von Ligandenbindungsdaten gebunden werden. Darüber hinaus stehen weitere Technologien zur Bewertung des zellulären Zielengagements zur Verfügung. Wir haben eine Reihe von Alternativen für die SHP2-Phosphatase untersucht, aber wir haben diesen Test als sehr nützlich in unseren Bemühungen gefunden. Schließlich ist dieser Assay unabhängig von der sHP2-enzymatischen Aktivität und ermöglicht somit die Auswertung und Optimierung kleiner Moleküle ohne Rücksicht auf deren Bindungsmodus.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte mit dem Inhalt dieses Artikels haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt von National Institutes of Health Grant 1R21CA195422 (an L. T.), Epstein Family Foundation Award (an N. D. P.C.) und NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199. Darüber hinaus wurde dieses Projekt ganz oder teilweise mit Bundesmitteln des National Cancer Institute, National Institutes of Health, im Rahmen des Chemical Biology Consortium Contract No finanziert. HHSN261200800001E. Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien des Department of Health and Human Services wider, noch impliziert die Erwähnung von Handelsnamen, kommerziellen Produkten oder Organisationen eine Billigung durch die US-Regierung. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well gradient equipped thermocycler Eppendorf AG X50h
384-well low dead volume microplate Echo qualified Beckman Coulter, Inc. LP-0200
6-well cell culture plates Greiner Bio-One 657 160 Sterile with lid
Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X Thermo Fisher Scientific 15240-062
Cell counter Thermo Fisher Scientific Countess II FL
Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 10566-016 500 mL
Echo acoustic liquid handler Beckman Coulter, Inc. Echo 550
Electronic multichannel pipette Thermo Fisher Scientific E1 ClipTip
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 26140-079 500 mL
HEPES buffer Thermo Fisher Scientific 15630-680 100 mL
InCell Pulse starter kit Eurofins DiscoverX Corp. 94-4007 Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate
Microplate reader Tecan Trading AG Spark
Single channel solution trough Thermo Fisher Scientific S253012005
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-010 100 mM
Thermal microplate sealer Agilent Technologies, Inc. PlateLoc
Transfection reagents Polyplus Transfection jetPRIME
Trypan blue Thermo Fisher Scientific T10282
TrypLE Express reagent Thermo Fisher Scientific 12605-010
Twin.tec 384 real-time PCR plates Eppendorf AG 30132734

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References

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