Natrium taurocholaat geïnduceerde ernstige acute pancreatitis bij C57BL/6 muizen
Summary
Diermodellen voor ernstige acute pancreatitis maken de studie van pathofysiologische veranderingen in de beginfase mogelijk, waardoor de observatie van de evolutie van ontstekingsgebeurtenissen wordt vergemakkelijkt. Hier bieden we een protocol voor de inductie van ernstige acute gal pancreatitis door retrograde infusie van natrium taurocholaat in het pancreaskanaal van verdoofde C57BL / 6-muizen.
Abstract
Biliaire acute pancreatitis inductie door natrium taurocholaat infusie is op grote schaal gebruikt door de wetenschappelijke gemeenschap als gevolg van de representatie van de menselijke klinische conditie en reproductie van inflammatoire gebeurtenissen die overeenkomen met het begin van klinische gal pancreatitis. De ernst van pancreasschade kan worden beoordeeld door de concentratie, snelheid en het volume van het geïnfundeerde galzuur te meten. Deze studie biedt een bijgewerkte checklist van de materialen en methoden die worden gebruikt in de protocolreproductie en toont de belangrijkste resultaten van dit acute pancreatitis (AP) -model. De meeste eerdere publicaties hebben zich beperkt tot het reproduceren van dit model bij ratten. We hebben deze methode toegepast bij muizen, wat extra voordelen biedt (d.w.z. de beschikbaarheid van een arsenaal aan reagentia en antilichamen voor deze dieren, samen met de mogelijkheid om te werken met genetisch gemodificeerde muizenstammen) die relevant kunnen zijn voor de studie. Voor acute pancreatitis-inductie bij muizen presenteren we een systematisch protocol, met een gedefinieerde dosis van 2,5% natrium taurocholaat bij een infusiesnelheid van 10 μL / min gedurende 3 minuten bij C57BL / 6-muizen die zijn maximale ernstniveau bereikt binnen 12 uur na inductie en de resultaten markeren met resultaten die de methode valideren. Met oefening en techniek is de totale geschatte tijd, van de inductie van anesthesie tot de voltooiing van de infusie, 25 minuten per dier.
Introduction
Bij mensen is de aanwezigheid van galstenen de meest voorkomende oorzaak van pancreatitis als gevolg van de obstructie van het terminale deel van de choledochal, waardoor de stroom van pancreassecreties wordt onderbroken en een intens ontstekingsproces in de pancreas wordt veroorzaakt, met een toename van de concentratie van spijsverteringsenzymen in het serum en ontstekingsmediatoren1,2.
Er zijn twee verschillende theorieën voorgesteld om de ontwikkeling van acute pancreatitis (AP) te verklaren. De “common channel” -theorie suggereert dat de stenen die in de galblaas aanwezig zijn, het distale gemeenschappelijke galkanaalsysteem belemmeren, waardoor galsecretie retrograde in de pancreaskanalen kan stromen. De tweede theorie (de “kanaalobstructie” -theorie) suggereert dat de obstructie van het pancreaskanaal door overtollige galstenen een blokkade veroorzaakt in de stroom van pancreassecretie naar de twaalfvingerige darm, waardoor ductale hypertensie3 ontstaat. Hoewel de mechanismen die leiden tot acute gal pancreatitis niet volledig worden begrepen, is het resultaat een intens ontstekingsproces. Spijsverteringsenzymuitbarsting en zelfvertering van de alvleesklier leiden tot histopathologische veranderingen, een toename van inflammatoire cytokines (IL-1β, IL-6, TNF-α) in ascitisch vocht en serum, en een toename van acute fase-eiwitten4,5,6.
Ernstige acute pancreatitis is een aandoening die klinische aandacht verdient vanwege de betrokkenheid van meerdere organen en een hoog sterfterisico. Diermodellen voor de reproductie van acute pancreatitis (AP) zijn belangrijk omdat deze de pathofysiologische mechanismen van de ziekte verklaren en helpen bij het volgen van de evolutie van ontstekingsgebeurtenissen, te beginnen met de beginfasen van de ziekte. Dit is meestal niet mogelijk in de klinieken2,7. Bovendien is de toegang tot pancreasweefsels gemakkelijk in preklinische studies, wat de opheldering van veranderingen in verband met klinische omstandigheden8 bevordert, samen met de mogelijkheid om met isogene soorten te werken, ongewenste variabelen te elimineren en klinische gelijkenis te weerspiegelen met de uitkomsten waargenomen in de menselijke conditie9.
Gal- en niet-galmodellen voor de inductie van acute pancreatitis bij ratten en muizensoorten zijn vaak bestudeerd in de wetenschappelijke literatuur. Niet-galwegmethoden voor inductie omvatten toediening van supramaximale stimulerende doses van de cholecystokinine secretagogue of zijn analoge cerulein10; toediening van bijna dodelijke doses L-arginine; of toediening van een choline-deficiënt dieet aangevuld met ethionine11. Hoewel deze methoden gemakkelijk te reproduceren zijn en resulteren in pancreasontsteking, repliceren ze niet de mechanismen die in theorie AP veroorzaken (d.w.z. de reflux van galsecretie in de pancreaskanalen). De techniek die het galmodel aanpakt, is gebaseerd op de retrograde infusie van galzuren in de pancreaskanalen en vereist goed opgeleide onderzoekers om dit protocol uit te voeren. Er zijn verschillende studies gepubliceerd met behulp van deze methode bij ratten (blijkbaar om technische redenen, aangezien deze experimenten chirurgische ingrepen omvatten)12,13. De aanpak bij muizen kan echter interessantere uitkomsten bieden in de studie van ontsteking3,14,15. In deze studie zullen we een checklist laten zien van de stappen die moeten worden gevolgd voor de reproductie van ernstige acute pancreatitis door infusie van natrium taurocholaat bij C57BL/6 verdoofde muizen.
Voor werken die de noodzaak van experimenten met antilichamen en analyse van de gen- en eiwitexpressie met zich meebrengen, heeft het gebruik van muizen de voorkeur vanwege het grotere arsenaal aan materialen voor deze dieren en de mogelijkheid om te werken met isogene en knock-out soorten, onder andere die relevant kunnen worden gebruikt voor studies16. Muizen C57BL/6 is een inteelt muizenstam die oorspronkelijk is ontwikkeld voor de studie van antitumoractiviteit en immunologie. Deze stam krijgt steeds meer de voorkeur van onderzoekers omdat het isogeen is, waardoor een grotere reproduceerbaarheid van de resultaten mogelijk is, wat het gebruik van een kleiner aantal dieren in een experiment en minder variabiliteit van de resultaten tussen dezelfde groep kan impliceren17,18.
Perides et al. (2010)14 publiceerden een protocol voor AP-inductie bij muizen door natrium taurocholaatinfusie. Hier werken we dit model bij met behulp van een hogere natrium taurocholaatconcentratie (2,5%) in C57BL/6 muizen, met een gedefinieerd volume en snelheid van infusie (figuur 1). Het maximale niveau van ernst wordt bereikt binnen 12 uur na inductie bij muizen. De verhoging van de concentratie van IL-6, zowel in het serum als in de peritoneale holte, is gecorreleerd met de progressie van AP. Met de praktijk is de totale geschatte tijd vanaf de inductie van anesthesie tot de voltooiing van de infusie 25 minuten per dier. Het is essentieel dat een getrainde onderzoeker dit experiment uitvoert. Om ervoor te zorgen dat de oplossing op de juiste manier in het gemeenschappelijke galkanaal wordt geïnjecteerd, voert u verschillende pilotentrainingen uit met methyleenblauw in plaats van natrium taurocholaat.
Protocol
Representative Results
Discussion
De methode voor het induceren van acute pancreatitis door retrograde natrium taurocholaatinfusie is al aangetoond bij ratten22,23,24. Drie soortgelijke werken, gepubliceerd in 2008, 2010 en 2015, dienden als referentie voor het protocol3,14,15. In dit werk vermelden we alle kritieke stappen voor het reproduceren van deze methode in C57B…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs dankzij het Post Graduation Program in de medische kliniek van de Universiteit van São Paulo; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) en University of São Paulo Medical School (FMUSP).
Materials
| 0.4 mm needle | INTRAG MEDICAL TECH | 90183210 | 30G |
| 0.54 mm polyethylene tube | Tygon | 730010 | – |
| Styrofoam block | – | – | – |
| masking tape for mounting the mouse | Missner | 1236 | – |
| Infusion pump scheduled to 10µL / min. | Havard aparatus-Peristaltic Pump Series | MA1 55-7766 | Model 66 Small Peristaltic |
| Scissors and forceps | |||
| Antiseptic providine iodine | Pfizer | 12086OR | antisepsis |
| 70% ethanol | SIGMA | 459836 | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O |
| Razor blade | Lord | bdk9a1ghk6 | For trichotomy |
| Sodium taurocholate | Sigma-Aldrich | 86339- 1G | CAS NUMBER- 345909-26-4 |
| microvessel clip | Medicon Surgical | 56.87.35 | Approximator, opening 4.0 mm, closing pressure 30 - 40 g |
| 6-0 prolene | Bioline | 5162 | Suture line |
| Ketamin NP (cloridrato de dextrocetamina) 50mg/mL | Cristália | ||
| Xilazine 2% | Syntec | ||
| Sterile saline solution (0.9% (wt/vol) saline) | Farmace | 105851 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich Chemicals | M5528 | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel – Immunology Multiplex Assay | MERCK | MCYTOMAG-70K | Simultaneously analyze multiple cytokine and chemokine biomarkers with Bead-Based Multiplex Assays using the Luminex technology, in mouse serum, plasma and cell culture samples. |
| Amylase Assay | Labtest | 11 | |
| Desmarres retractor 13-mm width |
ROBOZ | RS-6672 |
References
- Li, X., et al. Significantly different clinical features between hypertriglyceridemia and biliary acute pancreatitis: A retrospective study of 730 patients from a tertiary center. BMC Gastroenterology. 18 (1), 1-8 (2018).
- Rechreche, H., Abbes, A., Iovanna, J. L. Induction of antioxidant mechanisms in lung during experimental pancreatitis in rats. Indian Journal of Experimental Biology. 58 (5), 297-305 (2020).
- T, L., et al. Intraductal infusion of taurocholate followed by distal common bile duct ligation leads to a severe necrotic model of pancreatitis in mice. Pancreas. 44 (3), (2015).
- Botoi, G., Andercou, A. Interleukin 17-prognostic marker of severe acute pancreatitis. Chirurgia. 104 (4), 431-438 (2009).
- Li, D., Li, J., Wang, L., Zhang, Q. Association between IL-1beta, IL-8, and IL-10 polymorphisms and risk of acute pancreatitis. Genetics and Molecular Research. 14 (2), 6635-6641 (2015).
- Feng, C., et al. Effect of peritoneal lavage with ulinastatin on the expression of NF-kappaB and TNF-alpha in multiple organs of rats with severe acute pancreatitis. Experimental and Therapeutic Medicine. 10 (6), 2029-2034 (2015).
- Fang, D. Z., et al. Effects of sildenafil on inflammatory injury of the lung in sodium taurocholate-induced severe acute pancreatitis rats. International Immunopharmacology. 80, (2020).
- Ceranowicz, P., Cieszkowski, J., Warzecha, Z., Dembinski, A. Experimental models of acute pancreatitis. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej(Online). 69, 264-269 (2015).
- Wan, M. H., et al. Review of experimental animal models of biliary acute pancreatitis and recent advances in basic research. HPB (Oxford). 14 (2), 73-81 (2012).
- Mayerle, J., Sendler, M., Lerch, M. M. Secretagogue (Caerulein) induced pancreatitis in rodents. Pancreapedia: The Exocrine Pancreas Knowledge Base. (1), (2013).
- Wang, N., et al. Resveratrol protects against L-arginine-induced acute necrotizing pancreatitis in mice by enhancing SIRT1-mediated deacetylation of p53 and heat shock factor 1. International Journal of Molecular Medicine. 40 (2), 427-437 (2017).
- Ma, Z. H., et al. Effect of resveratrol on peritoneal macrophages in rats with severe acute pancreatitis. Inflammation Research. 54 (12), 522-527 (2005).
- Souza, L. J., et al. Anti-inflammatory effects of peritoneal lavage in acute pancreatitis. Pancreas. 39 (8), 1180-1184 (2010).
- Perides, G., Acker, G. J. v., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
- Wittel, U. A., et al. Taurocholate-induced pancreatitis: a model of severe necrotizing pancreatitis in mice. Pancreas. 36 (2), 9-21 (2008).
- Tao, L., Reese, T. A. Making mouse models that reflect human immune responses. Trends Immunology. 38 (3), 181-193 (2017).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Science. 6 (1), 2-9 (2014).
- Song, H. K., Hwang, D. Y. Use of C57BL/6N mice on the variety of immunological researches. Laboratory Animal Research. 33 (2), 119-123 (2017).
- Bogdanske, J. J., Stelle, S. H. -. V., Riley, M. V., Schiffman, B. M. . Suturing Principles and Techniques in Laboratory Animal Surgery. 1st edition. (1), (2010).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).
- Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Annals of Surgery. 215 (1), 44-56 (1992).
- Liu, D. L., et al. Resveratrol improves the therapeutic efficacy of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in rats with severe acute pancreatitis. International Immunopharmacology. 80, 106128 (2020).
- Yang, X. F., et al. Chaiqin chengqi decoction alleviates severe acute pancreatitis associated acute kidney injury by inhibiting endoplasmic reticulum stress and subsequent apoptosis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 125 (12), 110024 (2020).
- Yang, X. F., et al. Chaiqin chengqi decoction alleviates severe acute pancreatitis associated acute kidney injury by inhibiting endoplasmic reticulum stress and subsequent apoptosis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 125, 110024 (2020).
- Venglovecz, V., Z, R., Hegyi, P. The effects of bile acids on pancreatic ductal cells. Pancreapedia: The Exocrine Pancreas Knowledge Base. (1), (2019).
- Roberts, S. E., Akbari, A., Thorne, K., Atkinson, M., Evans, P. A. The incidence of acute pancreatitis: impact of social deprivation, alcohol consumption, seasonal and demographic factors. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 38 (5), 539-548 (2013).
- Lerch, M. M., Gorelick, F. S. Models of acute and chronic pancreatitis. Gastroenterology. 144 (6), 1180-1193 (2013).
- Nakamura, K., Fukatsu, K., Sasayama, A., Yamaji, T. An immune-modulating formula comprising whey peptides and fermented milk improves inflammation-related remote organ injuries in diet-induced acute pancreatitis in mice. Biosci Microbiota Food Health. 37 (1), 1-8 (2018).
- Kui, B., et al. New insights into the methodolgy of L-Arginine-induced acute pancreatitis. PLoS One. 10 (2), 011758 (2015).
- Xue, J., et al. Alternatively activated macrophages promote pancreatic fibrosis in chronic pancreatitis. Nature Communication. 6, 7158 (2015).
- Lesina, M., Wormann, S. M., Neuhofer, P., Song, L., Algul, H. Interleukin-6 in inflammatory and malignant diseases of the pancreas. Seminars in Immunology. 26 (1), 80-87 (2014).
- Rao, S. A., Kunte, A. R. Interleukin-6: An early predictive marker for severity of acute pancreatitis. Indian Journal of Critical Care Medicine. 21 (7), 424-428 (2017).
