Taurocolato de sodio inducido pancreatitis aguda grave en ratones C57BL/6
Summary
Los modelos animales para la pancreatitis aguda grave permiten el estudio de los cambios fisiopatológicos en la etapa inicial, facilitando la observación de la evolución de los eventos inflamatorios. Aquí proporcionamos un protocolo para la inducción de pancreatitis biliar aguda grave por infusión retrógrada de taurocolato de sodio en el conducto pancreático de ratones C57BL/ 6 anestesiados.
Abstract
La inducción de la pancreatitis aguda biliar por infusión de taurocolato de sodio ha sido ampliamente utilizada por la comunidad científica debido a la representación de la condición clínica humana y la reproducción de eventos inflamatorios correspondientes a la aparición de pancreatitis biliar clínica. La gravedad del daño pancreático se puede evaluar midiendo la concentración, la velocidad y el volumen del ácido biliar infundido. Este estudio proporciona una lista de verificación actualizada de los materiales y métodos utilizados en la reproducción del protocolo y muestra los principales resultados de este modelo de pancreatitis aguda (AP). La mayoría de las publicaciones anteriores se han limitado a reproducir este modelo en ratas. Hemos aplicado este método en ratones, lo que proporciona ventajas adicionales (es decir, la disponibilidad de un arsenal de reactivos y anticuerpos para estos animales junto con la posibilidad de trabajar con cepas de ratones modificadas genéticamente) que pueden ser relevantes para el estudio. Para la inducción de pancreatitis aguda en ratones, presentamos un protocolo sistemático, con una dosis definida de taurocolato de sodio al 2,5% a una velocidad de infusión de 10 μL/min durante 3 min en ratones C57BL/6 que alcanza su nivel máximo de gravedad dentro de las 12 h de la inducción y destaca los resultados con resultados que validan el método. Con la práctica y la técnica, el tiempo total estimado, desde la inducción de la anestesia hasta la finalización de la infusión, es de 25 min por animal.
Introduction
En humanos, la presencia de cálculos biliares es la causa más frecuente de pancreatitis debido a la obstrucción de la porción terminal del coledocal, interrumpiendo el flujo de secreciones pancreáticas y provocando un intenso proceso inflamatorio en el páncreas, con un aumento de la concentración de enzimas digestivas en el suero y mediadores inflamatorios1,2.
Se han propuesto dos teorías diferentes para explicar el desarrollo de la pancreatitis aguda (PA). La teoría del “canal común” sugiere que los cálculos presentes en la vesícula biliar obstruyen el sistema de conductos biliares comunes distales, permitiendo que la secreción biliar fluya retrógrada hacia el conducto pancreático. La segunda teoría (la teoría de la “obstrucción del conducto”) sugiere que la obstrucción del conducto pancreático por exceso de cálculos biliares provoca un bloqueo en el flujo de secreción pancreática al duodeno, causando hipertensión ductal3. Aunque los mecanismos que conducen a la pancreatitis biliar aguda no se comprenden completamente, el resultado es un proceso inflamatorio intenso. La erupción enzimática digestiva y la autodigestión del páncreas conducen a cambios histopatológicos, un aumento de las citoquinas inflamatorias (IL-1β, IL-6, TNF-α) en el líquido ascítico y el suero, y un aumento de las proteínas de fase aguda4,5,6.
La pancreatitis aguda grave es una afección que merece atención clínica debido a la afectación de múltiples órganos y a un alto riesgo de mortalidad. Los modelos animales para la reproducción de la pancreatitis aguda (PA) son importantes ya que explican los mecanismos fisiopatológicos de la enfermedad y ayudan a monitorear la evolución de los eventos inflamatorios, a partir de las etapas iniciales de la enfermedad. Esto generalmente no es posible en las clínicas2,7. Además, el acceso a los tejidos pancreáticos es fácil en estudios preclínicos, favoreciendo la elucidación de los cambios vinculados a las condiciones clínicas8 junto con la posibilidad de trabajar con especies isogénicas, eliminando variables indeseables y reflejando la similitud clínica con los resultados observados en la condición humana9.
Los modelos biliares y no biliares para la inducción de pancreatitis aguda en especies de ratas y ratones se han estudiado con frecuencia en la literatura científica. Los métodos no biliares de inducción incluyen la administración de dosis estimulantes supramáximas del secretagogo colecistoquinina o su análogo ceruleína10; administración de dosis casi letales de L-arginina; o la administración de una dieta deficiente en colina suplementada con etionina11. Aunque estos métodos son fáciles de reproducir y dan lugar a la inflamación pancreática, no replican los mecanismos que en teoría desencadenan la PA (es decir, el reflujo de la secreción biliar en el conducto pancreático). La técnica que aborda el modelo biliar se basa en la infusión retrógrada de ácidos biliares en el conducto pancreático y requiere de investigadores bien formados para llevar a cabo este protocolo. Se han publicado varios estudios utilizando este método en ratas (aparentemente por razones técnicas ya que estos experimentos implican procedimientos quirúrgicos)12,13. Sin embargo, el abordaje en ratones puede ofrecer resultados más interesantes en el estudio de la inflamación3,14,15. En este estudio, mostraremos una lista de verificación de los pasos a seguir para la reproducción de la pancreatitis aguda grave por infusión de taurocolato de sodio en ratones anestesiados C57BL/6.
Para trabajos que impliquen la necesidad de experimentos con anticuerpos y análisis de la expresión génica y proteica, es preferible el uso de ratones por el mayor arsenal de materiales para estos animales y la posibilidad de trabajar con especies isogénicas y knockout, entre otras que pueden ser utilizadas relevantes para estudios16. Ratones C57BL/6 es una cepa endogámica de ratones desarrollada originalmente para el estudio de la actividad antitumoral y la inmunología. Esta cepa está siendo cada vez más preferida por los investigadores por ser isogénica, lo que permite una mayor reproducibilidad de los resultados, lo que puede implicar el uso de un menor número de animales en un experimento y una menor variabilidad de resultados entre un mismo grupo17,18.
Perides et al. (2010)14 publicaron un protocolo para la inducción de AP en ratones por infusión de taurocolato de sodio. Aquí actualizamos este modelo utilizando una mayor concentración de taurocolato de sodio (2,5%) en ratones C57BL/6, con un volumen y velocidad de infusión definidos (Figura 1). El nivel máximo de gravedad se alcanza dentro de las 12 h de la inducción en ratones. La elevación de la concentración de IL-6 tanto en el suero como en la cavidad peritoneal se correlaciona con la progresión de la PA. Con la práctica, el tiempo total estimado desde la inducción de la anestesia hasta la finalización de la infusión, es de 25 min por animal. Es esencial que un investigador capacitado realice este experimento. Para asegurarse de que la solución se inyecta correctamente en el conducto biliar común, realice varias sesiones de entrenamiento piloto utilizando azul de metileno en lugar de taurocolato de sodio.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método de inducción de la pancreatitis aguda por infusión retrógrada de taurocolato de sodio ya se ha demostrado en ratas22,23,24. Tres trabajos similares, publicados en 2008, 2010 y 2015, sirvieron de referencia para el protocolo3,14,15. En este trabajo, enumeramos todos los pasos críticos para reproducir este método en ratone…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen el Programa de Postgrado en Clínica Médica de la Universidad de São Paulo; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) y Facultad de Medicina de la Universidad de São Paulo (FMUSP).
Materials
| 0.4 mm needle | INTRAG MEDICAL TECH | 90183210 | 30G |
| 0.54 mm polyethylene tube | Tygon | 730010 | – |
| Styrofoam block | – | – | – |
| masking tape for mounting the mouse | Missner | 1236 | – |
| Infusion pump scheduled to 10µL / min. | Havard aparatus-Peristaltic Pump Series | MA1 55-7766 | Model 66 Small Peristaltic |
| Scissors and forceps | |||
| Antiseptic providine iodine | Pfizer | 12086OR | antisepsis |
| 70% ethanol | SIGMA | 459836 | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O |
| Razor blade | Lord | bdk9a1ghk6 | For trichotomy |
| Sodium taurocholate | Sigma-Aldrich | 86339- 1G | CAS NUMBER- 345909-26-4 |
| microvessel clip | Medicon Surgical | 56.87.35 | Approximator, opening 4.0 mm, closing pressure 30 - 40 g |
| 6-0 prolene | Bioline | 5162 | Suture line |
| Ketamin NP (cloridrato de dextrocetamina) 50mg/mL | Cristália | ||
| Xilazine 2% | Syntec | ||
| Sterile saline solution (0.9% (wt/vol) saline) | Farmace | 105851 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich Chemicals | M5528 | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel – Immunology Multiplex Assay | MERCK | MCYTOMAG-70K | Simultaneously analyze multiple cytokine and chemokine biomarkers with Bead-Based Multiplex Assays using the Luminex technology, in mouse serum, plasma and cell culture samples. |
| Amylase Assay | Labtest | 11 | |
| Desmarres retractor 13-mm width |
ROBOZ | RS-6672 |
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