Вызванный таурохолатом натрия тяжелый острый панкреатит у мышей C57BL/6
Summary
Животные модели тяжелого острого панкреатита позволяют изучать патофизиологические изменения на начальной стадии, облегчая наблюдение за эволюцией воспалительных явлений. Здесь мы приводим протокол индукции тяжелого острого билиарного панкреатита ретроградной инфузией таурохолата натрия в проток поджелудочной железы анестезированных мышей C57BL/6.
Abstract
Индукция билиарного острого панкреатита путем инфузии таурохолата натрия широко используется научным сообществом благодаря представлению клинического состояния человека и воспроизведению воспалительных событий, соответствующих наступлению клинического билиарного панкреатита. Тяжесть повреждения поджелудочной железы может быть оценена путем измерения концентрации, скорости и объема введенной желчной кислоты. Это исследование предоставляет обновленный контрольный список материалов и методов, используемых в воспроизведении протокола, и показывает основные результаты этой модели острого панкреатита (АП). Большинство предыдущих публикаций ограничились воспроизведением этой модели на крысах. Мы применили этот метод на мышах, что дает дополнительные преимущества (т.е. наличие арсенала реагентов и антител для этих животных наряду с возможностью работы с генетически модифицированными штаммами мышей), которые могут иметь отношение к исследованию. Для индукции острого панкреатита у мышей мы представляем систематический протокол с определенной дозой 2,5% таурохолата натрия со скоростью инфузии 10 мкл / мин в течение 3 мин у мышей C57BL / 6, которая достигает максимального уровня тяжести в течение 12 ч после индукции и выделяет результаты с результатами, которые подтверждают метод. При практике и технике общее расчетное время, от индукции анестезии до завершения инфузии, составляет 25 минут на животное.
Introduction
У человека наличие желчных камней является наиболее частой причиной панкреатита из-за непроходимости терминального участка холедохала, прерывая течение выделений поджелудочной железы и вызывая интенсивный воспалительный процесс в поджелудочной железе, с повышением концентрации пищеварительных ферментов в сыворотке крови и медиаторов воспаления1,2.
Для объяснения развития острого панкреатита (АП) были предложены две различные теории. Теория «общего канала» предполагает, что камни, присутствующие в желчном пузыре, препятствуют дистальной системе общих желчных протоков, позволяя секреции желчи течь ретроградно в проток поджелудочной железы. Вторая теория (теория «обструкции протоков») предполагает, что обструкция протока поджелудочной железы избытком желчных камней вызывает закупорку потока секреции поджелудочной железы в двенадцатиперстную кишку, вызывая протоковую гипертензию3. Хотя механизмы, приводящие к острому билиарному панкреатиту, до конца не изучены, исходом является интенсивный воспалительный процесс. Извержение пищеварительного фермента и самопереваривание поджелудочной железы приводят к гистопатологическим изменениям, увеличению воспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6, TNF-α) в асцитической жидкости и сыворотке крови, увеличению белков острой фазы4,5,6.
Тяжелый острый панкреатит – это состояние, которое заслуживает клинического внимания из-за вовлечения нескольких органов и высокого риска смертности. Животные модели для размножения острого панкреатита (АП) важны, поскольку они объясняют патофизиологические механизмы заболевания и помогают в мониторинге эволюции воспалительных событий, начиная с начальных стадий заболевания. Обычно это невозможно в клиниках2,7. Кроме того, доступ к тканям поджелудочной железы прост в доклинических исследованиях, что способствует выяснению изменений, связанных с клиническими условиями8, наряду с возможностью работы с изогенными видами, устранения нежелательных переменных и отражения клинического сходства с результатами, наблюдаемыми в человеческом состоянии9.
Билиарные и небилиарные модели индукции острого панкреатита у видов крыс и мышей часто изучались в научной литературе. Небилиарные методы индукции включают введение супрамаксимальных стимулирующих доз холецистокинина секретагога или его аналога церулеина10; введение практически летальных доз L-аргинина; или введение диеты с дефицитом холина, дополненной этионином11. Хотя эти методы легко воспроизвести и привести к воспалению поджелудочной железы, они не воспроизводят механизмы, которые теоретически запускают АП (то есть рефлюкс секреции желчи в проток поджелудочной железы). Метод, который обращается к билиарной модели, основан на ретроградной инфузии желчных кислот в проток поджелудочной железы и требует хорошо подготовленных исследователей для выполнения этого протокола. Было опубликовано несколько исследований с использованием этого метода на крысах (по-видимому, по техническим причинам, поскольку эти эксперименты включают хирургические процедуры)12,13. Тем не менее, подход на мышах может предложить более интересные результаты в исследовании воспаления3,14,15. В этом исследовании мы покажем контрольный список шагов, которые необходимо соблюдать для размножения тяжелого острого панкреатита путем инфузии таурохолата натрия у обезболенных мышей C57BL/6.
Для работ, которые предполагают необходимость экспериментов с антителами и анализа экспрессии гена и белка, использование мышей предпочтительнее из-за большего арсенала материалов для этих животных и возможности работы с изогенными и нокаутирующими видами, среди прочих, которые могут быть использованы в отношении исследований16. Мыши C57BL/6 — инбредный штамм мышей, первоначально разработанный для изучения противоопухолевой активности и иммунологии. Этот штамм все чаще предпочитается исследователями за то, что он изогенен, что обеспечивает большую воспроизводимость результатов, что может подразумевать использование меньшего количества животных в эксперименте и меньшую изменчивость результатов между одной и той же группой17,18.
Perides et al. (2010)14 опубликовали протокол индукции АП у мышей путем инфузии таурохолата натрия. Здесь мы обновляем эту модель, используя более высокую концентрацию таурохолата натрия (2,5%) у мышей C57BL/6 с определенным объемом и скоростью инфузии (рисунок 1). Максимальный уровень тяжести достигается в течение 12 ч после индукции у мышей. Повышение концентрации IL-6 как в сыворотке крови, так и в брюшной полости коррелирует с прогрессированием АП. При практике общее расчетное время от индукции анестезии до завершения инфузии, составляет 25 мин на животное. Важно, чтобы этот эксперимент проводил обученный исследователь. Чтобы убедиться, что раствор правильно введен в общий желчный проток, выполните несколько пилотных тренировок с использованием метиленового синего вместо таурохолата натрия.
Protocol
Representative Results
Discussion
Способ индуцирования острого панкреатита ретроградной инфузией таурохолата натрия уже показан у крыс22,23,24. Три подобные работы, опубликованные в 2008, 2010 и 2015 годах, послужили справочным материалом для протокола3,14,15.<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят программу последипломного образования в медицинской клинике Университета Сан-Паулу; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) и Медицинская школа Университета Сан-Паулу (FMUSP).
Materials
| 0.4 mm needle | INTRAG MEDICAL TECH | 90183210 | 30G |
| 0.54 mm polyethylene tube | Tygon | 730010 | – |
| Styrofoam block | – | – | – |
| masking tape for mounting the mouse | Missner | 1236 | – |
| Infusion pump scheduled to 10µL / min. | Havard aparatus-Peristaltic Pump Series | MA1 55-7766 | Model 66 Small Peristaltic |
| Scissors and forceps | |||
| Antiseptic providine iodine | Pfizer | 12086OR | antisepsis |
| 70% ethanol | SIGMA | 459836 | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O |
| Razor blade | Lord | bdk9a1ghk6 | For trichotomy |
| Sodium taurocholate | Sigma-Aldrich | 86339- 1G | CAS NUMBER- 345909-26-4 |
| microvessel clip | Medicon Surgical | 56.87.35 | Approximator, opening 4.0 mm, closing pressure 30 - 40 g |
| 6-0 prolene | Bioline | 5162 | Suture line |
| Ketamin NP (cloridrato de dextrocetamina) 50mg/mL | Cristália | ||
| Xilazine 2% | Syntec | ||
| Sterile saline solution (0.9% (wt/vol) saline) | Farmace | 105851 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich Chemicals | M5528 | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel – Immunology Multiplex Assay | MERCK | MCYTOMAG-70K | Simultaneously analyze multiple cytokine and chemokine biomarkers with Bead-Based Multiplex Assays using the Luminex technology, in mouse serum, plasma and cell culture samples. |
| Amylase Assay | Labtest | 11 | |
| Desmarres retractor 13-mm width |
ROBOZ | RS-6672 |
References
- Li, X., et al. Significantly different clinical features between hypertriglyceridemia and biliary acute pancreatitis: A retrospective study of 730 patients from a tertiary center. BMC Gastroenterology. 18 (1), 1-8 (2018).
- Rechreche, H., Abbes, A., Iovanna, J. L. Induction of antioxidant mechanisms in lung during experimental pancreatitis in rats. Indian Journal of Experimental Biology. 58 (5), 297-305 (2020).
- T, L., et al. Intraductal infusion of taurocholate followed by distal common bile duct ligation leads to a severe necrotic model of pancreatitis in mice. Pancreas. 44 (3), (2015).
- Botoi, G., Andercou, A. Interleukin 17-prognostic marker of severe acute pancreatitis. Chirurgia. 104 (4), 431-438 (2009).
- Li, D., Li, J., Wang, L., Zhang, Q. Association between IL-1beta, IL-8, and IL-10 polymorphisms and risk of acute pancreatitis. Genetics and Molecular Research. 14 (2), 6635-6641 (2015).
- Feng, C., et al. Effect of peritoneal lavage with ulinastatin on the expression of NF-kappaB and TNF-alpha in multiple organs of rats with severe acute pancreatitis. Experimental and Therapeutic Medicine. 10 (6), 2029-2034 (2015).
- Fang, D. Z., et al. Effects of sildenafil on inflammatory injury of the lung in sodium taurocholate-induced severe acute pancreatitis rats. International Immunopharmacology. 80, (2020).
- Ceranowicz, P., Cieszkowski, J., Warzecha, Z., Dembinski, A. Experimental models of acute pancreatitis. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej(Online). 69, 264-269 (2015).
- Wan, M. H., et al. Review of experimental animal models of biliary acute pancreatitis and recent advances in basic research. HPB (Oxford). 14 (2), 73-81 (2012).
- Mayerle, J., Sendler, M., Lerch, M. M. Secretagogue (Caerulein) induced pancreatitis in rodents. Pancreapedia: The Exocrine Pancreas Knowledge Base. (1), (2013).
- Wang, N., et al. Resveratrol protects against L-arginine-induced acute necrotizing pancreatitis in mice by enhancing SIRT1-mediated deacetylation of p53 and heat shock factor 1. International Journal of Molecular Medicine. 40 (2), 427-437 (2017).
- Ma, Z. H., et al. Effect of resveratrol on peritoneal macrophages in rats with severe acute pancreatitis. Inflammation Research. 54 (12), 522-527 (2005).
- Souza, L. J., et al. Anti-inflammatory effects of peritoneal lavage in acute pancreatitis. Pancreas. 39 (8), 1180-1184 (2010).
- Perides, G., Acker, G. J. v., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
- Wittel, U. A., et al. Taurocholate-induced pancreatitis: a model of severe necrotizing pancreatitis in mice. Pancreas. 36 (2), 9-21 (2008).
- Tao, L., Reese, T. A. Making mouse models that reflect human immune responses. Trends Immunology. 38 (3), 181-193 (2017).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Science. 6 (1), 2-9 (2014).
- Song, H. K., Hwang, D. Y. Use of C57BL/6N mice on the variety of immunological researches. Laboratory Animal Research. 33 (2), 119-123 (2017).
- Bogdanske, J. J., Stelle, S. H. -. V., Riley, M. V., Schiffman, B. M. . Suturing Principles and Techniques in Laboratory Animal Surgery. 1st edition. (1), (2010).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).
- Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Annals of Surgery. 215 (1), 44-56 (1992).
- Liu, D. L., et al. Resveratrol improves the therapeutic efficacy of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in rats with severe acute pancreatitis. International Immunopharmacology. 80, 106128 (2020).
- Yang, X. F., et al. Chaiqin chengqi decoction alleviates severe acute pancreatitis associated acute kidney injury by inhibiting endoplasmic reticulum stress and subsequent apoptosis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 125 (12), 110024 (2020).
- Yang, X. F., et al. Chaiqin chengqi decoction alleviates severe acute pancreatitis associated acute kidney injury by inhibiting endoplasmic reticulum stress and subsequent apoptosis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 125, 110024 (2020).
- Venglovecz, V., Z, R., Hegyi, P. The effects of bile acids on pancreatic ductal cells. Pancreapedia: The Exocrine Pancreas Knowledge Base. (1), (2019).
- Roberts, S. E., Akbari, A., Thorne, K., Atkinson, M., Evans, P. A. The incidence of acute pancreatitis: impact of social deprivation, alcohol consumption, seasonal and demographic factors. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 38 (5), 539-548 (2013).
- Lerch, M. M., Gorelick, F. S. Models of acute and chronic pancreatitis. Gastroenterology. 144 (6), 1180-1193 (2013).
- Nakamura, K., Fukatsu, K., Sasayama, A., Yamaji, T. An immune-modulating formula comprising whey peptides and fermented milk improves inflammation-related remote organ injuries in diet-induced acute pancreatitis in mice. Biosci Microbiota Food Health. 37 (1), 1-8 (2018).
- Kui, B., et al. New insights into the methodolgy of L-Arginine-induced acute pancreatitis. PLoS One. 10 (2), 011758 (2015).
- Xue, J., et al. Alternatively activated macrophages promote pancreatic fibrosis in chronic pancreatitis. Nature Communication. 6, 7158 (2015).
- Lesina, M., Wormann, S. M., Neuhofer, P., Song, L., Algul, H. Interleukin-6 in inflammatory and malignant diseases of the pancreas. Seminars in Immunology. 26 (1), 80-87 (2014).
- Rao, S. A., Kunte, A. R. Interleukin-6: An early predictive marker for severity of acute pancreatitis. Indian Journal of Critical Care Medicine. 21 (7), 424-428 (2017).
