Natriumtaurocolat induzierte schwere akute Pankreatitis bei C57BL/6 Mäusen
Summary
Tiermodelle für schwere akute Pankreatitis ermöglichen die Untersuchung pathophysiologischer Veränderungen im Anfangsstadium und erleichtern die Beobachtung der Evolution von Entzündungsereignissen. Hier stellen wir ein Protokoll für die Induktion einer schweren akuten biliären Pankreatitis durch retrograde Infusion von Natriumtaurocholat in den Pankreasgang von anästhesierten C57BL/6-Mäusen zur Verfügung.
Abstract
Die Induktion einer biliären akuten Pankreatitis durch Natriumtautolett-Infusion wurde von der wissenschaftlichen Gemeinschaft aufgrund der Darstellung des klinischen Zustands des Menschen und der Reproduktion entzündlicher Ereignisse, die dem Beginn der klinischen biliären Pankreatitis entsprechen, weit verbreitet verwendet. Die Schwere der Pankreasschädigung kann durch Messung der Konzentration, Geschwindigkeit und des Volumens der infundierten Gallensäure beurteilt werden. Diese Studie bietet eine aktualisierte Checkliste der Materialien und Methoden, die bei der Protokollreproduktion verwendet werden, und zeigt die wichtigsten Ergebnisse dieses akuten Pankreatitis (AP) -Modells. Die meisten früheren Veröffentlichungen haben sich darauf beschränkt, dieses Modell bei Ratten zu reproduzieren. Wir haben diese Methode bei Mäusen angewendet, die zusätzliche Vorteile bietet (d.h. die Verfügbarkeit eines Arsenals von Reagenzien und Antikörpern für diese Tiere zusammen mit der Möglichkeit, mit genetisch veränderten Mäusstämmen zu arbeiten), die für die Studie relevant sein könnten. Für die Induktion einer akuten Pankreatitis bei Mäusen präsentieren wir ein systematisches Protokoll mit einer definierten Dosis von 2,5% Natriumtarocholat bei einer Infusionsgeschwindigkeit von 10 μL/min für 3 min bei C57BL/6-Mäusen, die ihren maximalen Schweregrad innerhalb von 12 h nach der Induktion erreichen, und heben Ergebnisse mit Ergebnissen hervor, die die Methode validieren. Mit Übung und Technik beträgt die geschätzte Gesamtzeit von der Einleitung der Anästhesie bis zum Abschluss der Infusion 25 Minuten pro Tier.
Introduction
Beim Menschen ist das Vorhandensein von Gallensteinen die häufigste Ursache für eine Pankreatitis aufgrund der Obstruktion des terminalen Teils des Choledochals, die den Fluss der Pankreassekrete unterbricht und einen intensiven Entzündungsprozess in der Bauchspeicheldrüse verursacht, mit einer Erhöhung der Konzentration von Verdauungsenzymen im Serum und Entzündungsmediatoren1,2.
Zwei verschiedene Theorien wurden vorgeschlagen, um die Entwicklung einer akuten Pankreatitis (AP) zu erklären. Die Theorie des “gemeinsamen Kanals” legt nahe, dass die in der Gallenblase vorhandenen Steine das distale gemeinsame Gallengangssystem behindern, so dass die Gallensekretion retrograd in den Pankreasgang fließen kann. Die zweite Theorie (die Theorie der “Gangobstruktion”) legt nahe, dass die Obstruktion des Pankreasgangs durch überschüssige Gallensteine eine Blockade im Fluss der Pankreassekretion zum Zwölffingerdarm verursacht, was zu einer duktalen Hypertonie führt3. Obwohl die Mechanismen, die zu einer akuten biliären Pankreatitis führen, nicht vollständig verstanden sind, ist das Ergebnis ein intensiver Entzündungsprozess. Der Ausbruch des Verdauungsenzyms und die Selbstverdauung der Bauchspeicheldrüse führen zu histopathologischen Veränderungen, einem Anstieg der entzündlichen Zytokine (IL-1β, IL-6, TNF-α) in der Aszitflüssigkeit und im Serum sowie zu einem Anstieg der Proteine in der akuten Phase4,5,6.
Schwere akute Pankreatitis ist eine Erkrankung, die aufgrund der Beteiligung mehrerer Organe und eines hohen Mortalitätsrisikos klinische Aufmerksamkeit verdient. Tiermodelle für die Reproduktion der akuten Pankreatitis (AP) sind wichtig, da sie die pathophysiologischen Mechanismen der Krankheit erklären und bei der Überwachung der Entwicklung von Entzündungsereignissen ab den Anfangsstadien der Krankheit helfen. Dies ist in den Kliniken in der Regel nicht möglich2,7. Darüber hinaus ist der Zugang zu Pankreasgewebe in präklinischen Studien einfach, was die Aufklärung von Veränderungen im Zusammenhang mit klinischen Bedingungen8 sowie die Möglichkeit der Arbeit mit isogenen Spezies, die Beseitigung unerwünschter Variablen und die Spiegelung der klinischen Ähnlichkeit mit den im menschlichen Zustand beobachteten Ergebnissen begünstigt9.
Biliäre und nicht-biliäre Modelle für die Induktion einer akuten Pankreatitis bei Ratten und Mäusen wurden in der wissenschaftlichen Literatur häufig untersucht. Nicht-biliäre Induktionsmethoden umfassen die Verabreichung von supramaximalen stimulierenden Dosen des Cholecystokinin-Sekretagogue oder seines analogen Cerulein10; Verabreichung von fast tödlichen Dosen von L-Arginin; oder Verabreichung einer cholinarmen Diät, die mit Ethionin11 ergänzt wird. Obwohl diese Methoden leicht zu reproduzieren sind und zu einer Bauchspeicheldrüsenentzündung führen, replizieren sie nicht die Mechanismen, die theoretisch AP auslösen (dh den Rückfluss von Gallensekretion in den Pankreasgang). Die Technik, die das Gallenmodell anspricht, basiert auf der retrograden Infusion von Gallensäuren in den Pankreasgang und erfordert gut ausgebildete Forscher, um dieses Protokoll durchzuführen. Mehrere Studien wurden mit dieser Methode an Ratten veröffentlicht (offenbar aus technischen Gründen, da diese Experimente chirurgische Eingriffe beinhalten)12,13. Der Ansatz bei Mäusen könnte jedoch interessantere Ergebnisse in der Studie über Entzündungen liefern3,14,15. In dieser Studie zeigen wir eine Checkliste der Schritte, die für die Reproduktion einer schweren akuten Pankreatitis durch Infusion von Natriumtaurocholat in C57BL/6 anästhesierten Mäusen zu befolgen sind.
Für Arbeiten, die Experimente mit Antikörpern und die Analyse der Gen- und Proteinexpression erfordern, ist die Verwendung von Mäusen vorzuziehen, da das Materialarsenal für diese Tiere größer ist und die Möglichkeit besteht, unter anderem mit isogenen und Knockout-Spezies zu arbeiten, die für Studien relevant sind16. Mäuse C57BL/6 ist ein Inzuchtstamm von Mäusen, der ursprünglich für das Studium der Antitumoraktivität und Immunologie entwickelt wurde. Dieser Stamm wird von den Forschern zunehmend bevorzugt, da er isogen ist, was eine größere Reproduzierbarkeit der Ergebnisse ermöglicht, was die Verwendung einer kleineren Anzahl von Tieren in einem Versuch und eine geringere Variabilität der Ergebnisse zwischen derselben Gruppe bedeuten kann17,18.
Perides et al. (2010)14 veröffentlichten ein Protokoll für die AP-Induktion bei Mäusen durch Natriumtaurocholat-Infusion. Hier aktualisieren wir dieses Modell unter Verwendung einer höheren Natriumtaurocilatkonzentration (2,5%) in C57BL/6-Mäusen mit einem definierten Volumen und einer definierten Infusionsgeschwindigkeit (Abbildung 1). Der maximale Schweregrad wird bei Mäusen innerhalb von 12 h nach der Induktion erreicht. Die Erhöhung der Konzentration von IL-6 sowohl im Serum als auch in der Peritonealhöhle korreliert mit dem Fortschreiten der AP. In der Praxis beträgt die geschätzte Gesamtzeit von der Einleitung der Anästhesie bis zum Abschluss der Infusion 25 Minuten pro Tier. Es ist wichtig, dass ein ausgebildeter Forscher dieses Experiment durchführt. Um sicherzustellen, dass die Lösung ordnungsgemäß in den gemeinsamen Gallengang injiziert wird, führen Sie mehrere Pilottrainingseinheiten mit Methylenblau anstelle von Natriumtaurocholat durch.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Methode zur Induktion einer akuten Pankreatitis durch retrograde Natriumtaurocholat-Infusion wurde bereits bei Ratten gezeigt22,23,24. Drei ähnliche Werke, die 2008, 2010 und 2015 veröffentlicht wurden, dienten als Referenz für das Protokoll3,14,15. In dieser Arbeit listen wir alle kritischen Schritte zur Reproduktion dieser Meth…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken dem Postgraduiertenprogramm in der Medizinischen Klinik der Universität von São Paulo; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) und University of São Paulo Medical School (FMUSP).
Materials
| 0.4 mm needle | INTRAG MEDICAL TECH | 90183210 | 30G |
| 0.54 mm polyethylene tube | Tygon | 730010 | – |
| Styrofoam block | – | – | – |
| masking tape for mounting the mouse | Missner | 1236 | – |
| Infusion pump scheduled to 10µL / min. | Havard aparatus-Peristaltic Pump Series | MA1 55-7766 | Model 66 Small Peristaltic |
| Scissors and forceps | |||
| Antiseptic providine iodine | Pfizer | 12086OR | antisepsis |
| 70% ethanol | SIGMA | 459836 | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O |
| Razor blade | Lord | bdk9a1ghk6 | For trichotomy |
| Sodium taurocholate | Sigma-Aldrich | 86339- 1G | CAS NUMBER- 345909-26-4 |
| microvessel clip | Medicon Surgical | 56.87.35 | Approximator, opening 4.0 mm, closing pressure 30 - 40 g |
| 6-0 prolene | Bioline | 5162 | Suture line |
| Ketamin NP (cloridrato de dextrocetamina) 50mg/mL | Cristália | ||
| Xilazine 2% | Syntec | ||
| Sterile saline solution (0.9% (wt/vol) saline) | Farmace | 105851 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich Chemicals | M5528 | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel – Immunology Multiplex Assay | MERCK | MCYTOMAG-70K | Simultaneously analyze multiple cytokine and chemokine biomarkers with Bead-Based Multiplex Assays using the Luminex technology, in mouse serum, plasma and cell culture samples. |
| Amylase Assay | Labtest | 11 | |
| Desmarres retractor 13-mm width |
ROBOZ | RS-6672 |
References
- Li, X., et al. Significantly different clinical features between hypertriglyceridemia and biliary acute pancreatitis: A retrospective study of 730 patients from a tertiary center. BMC Gastroenterology. 18 (1), 1-8 (2018).
- Rechreche, H., Abbes, A., Iovanna, J. L. Induction of antioxidant mechanisms in lung during experimental pancreatitis in rats. Indian Journal of Experimental Biology. 58 (5), 297-305 (2020).
- T, L., et al. Intraductal infusion of taurocholate followed by distal common bile duct ligation leads to a severe necrotic model of pancreatitis in mice. Pancreas. 44 (3), (2015).
- Botoi, G., Andercou, A. Interleukin 17-prognostic marker of severe acute pancreatitis. Chirurgia. 104 (4), 431-438 (2009).
- Li, D., Li, J., Wang, L., Zhang, Q. Association between IL-1beta, IL-8, and IL-10 polymorphisms and risk of acute pancreatitis. Genetics and Molecular Research. 14 (2), 6635-6641 (2015).
- Feng, C., et al. Effect of peritoneal lavage with ulinastatin on the expression of NF-kappaB and TNF-alpha in multiple organs of rats with severe acute pancreatitis. Experimental and Therapeutic Medicine. 10 (6), 2029-2034 (2015).
- Fang, D. Z., et al. Effects of sildenafil on inflammatory injury of the lung in sodium taurocholate-induced severe acute pancreatitis rats. International Immunopharmacology. 80, (2020).
- Ceranowicz, P., Cieszkowski, J., Warzecha, Z., Dembinski, A. Experimental models of acute pancreatitis. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej(Online). 69, 264-269 (2015).
- Wan, M. H., et al. Review of experimental animal models of biliary acute pancreatitis and recent advances in basic research. HPB (Oxford). 14 (2), 73-81 (2012).
- Mayerle, J., Sendler, M., Lerch, M. M. Secretagogue (Caerulein) induced pancreatitis in rodents. Pancreapedia: The Exocrine Pancreas Knowledge Base. (1), (2013).
- Wang, N., et al. Resveratrol protects against L-arginine-induced acute necrotizing pancreatitis in mice by enhancing SIRT1-mediated deacetylation of p53 and heat shock factor 1. International Journal of Molecular Medicine. 40 (2), 427-437 (2017).
- Ma, Z. H., et al. Effect of resveratrol on peritoneal macrophages in rats with severe acute pancreatitis. Inflammation Research. 54 (12), 522-527 (2005).
- Souza, L. J., et al. Anti-inflammatory effects of peritoneal lavage in acute pancreatitis. Pancreas. 39 (8), 1180-1184 (2010).
- Perides, G., Acker, G. J. v., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
- Wittel, U. A., et al. Taurocholate-induced pancreatitis: a model of severe necrotizing pancreatitis in mice. Pancreas. 36 (2), 9-21 (2008).
- Tao, L., Reese, T. A. Making mouse models that reflect human immune responses. Trends Immunology. 38 (3), 181-193 (2017).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Science. 6 (1), 2-9 (2014).
- Song, H. K., Hwang, D. Y. Use of C57BL/6N mice on the variety of immunological researches. Laboratory Animal Research. 33 (2), 119-123 (2017).
- Bogdanske, J. J., Stelle, S. H. -. V., Riley, M. V., Schiffman, B. M. . Suturing Principles and Techniques in Laboratory Animal Surgery. 1st edition. (1), (2010).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).
- Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Annals of Surgery. 215 (1), 44-56 (1992).
- Liu, D. L., et al. Resveratrol improves the therapeutic efficacy of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in rats with severe acute pancreatitis. International Immunopharmacology. 80, 106128 (2020).
- Yang, X. F., et al. Chaiqin chengqi decoction alleviates severe acute pancreatitis associated acute kidney injury by inhibiting endoplasmic reticulum stress and subsequent apoptosis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 125 (12), 110024 (2020).
- Yang, X. F., et al. Chaiqin chengqi decoction alleviates severe acute pancreatitis associated acute kidney injury by inhibiting endoplasmic reticulum stress and subsequent apoptosis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 125, 110024 (2020).
- Venglovecz, V., Z, R., Hegyi, P. The effects of bile acids on pancreatic ductal cells. Pancreapedia: The Exocrine Pancreas Knowledge Base. (1), (2019).
- Roberts, S. E., Akbari, A., Thorne, K., Atkinson, M., Evans, P. A. The incidence of acute pancreatitis: impact of social deprivation, alcohol consumption, seasonal and demographic factors. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 38 (5), 539-548 (2013).
- Lerch, M. M., Gorelick, F. S. Models of acute and chronic pancreatitis. Gastroenterology. 144 (6), 1180-1193 (2013).
- Nakamura, K., Fukatsu, K., Sasayama, A., Yamaji, T. An immune-modulating formula comprising whey peptides and fermented milk improves inflammation-related remote organ injuries in diet-induced acute pancreatitis in mice. Biosci Microbiota Food Health. 37 (1), 1-8 (2018).
- Kui, B., et al. New insights into the methodolgy of L-Arginine-induced acute pancreatitis. PLoS One. 10 (2), 011758 (2015).
- Xue, J., et al. Alternatively activated macrophages promote pancreatic fibrosis in chronic pancreatitis. Nature Communication. 6, 7158 (2015).
- Lesina, M., Wormann, S. M., Neuhofer, P., Song, L., Algul, H. Interleukin-6 in inflammatory and malignant diseases of the pancreas. Seminars in Immunology. 26 (1), 80-87 (2014).
- Rao, S. A., Kunte, A. R. Interleukin-6: An early predictive marker for severity of acute pancreatitis. Indian Journal of Critical Care Medicine. 21 (7), 424-428 (2017).
