सोडियम टॉरोकोलेट प्रेरित गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ C57BL/
Summary
गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ के लिए पशु मॉडल प्रारंभिक चरण में pathophysiological परिवर्तनों के अध्ययन को सक्षम करते हैं, जो भड़काऊ घटनाओं के विकास के अवलोकन की सुविधा प्रदान करते हैं। यहां हम एनेस्थेटिक C57BL / 6 चूहों के अग्नाशय वाहिनी में सोडियम टॉरोकोलेट के प्रतिगामी जलसेक द्वारा गंभीर तीव्र पित्त अग्नाशयशोथ के प्रेरण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।
Abstract
सोडियम टॉरोकोलेट जलसेक द्वारा पित्त तीव्र अग्नाशयशोथ प्रेरण का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, जिसका उपयोग वैज्ञानिक समुदाय द्वारा मानव नैदानिक स्थिति के प्रतिनिधित्व और नैदानिक पित्त अग्नाशयशोथ की शुरुआत के अनुरूप भड़काऊ घटनाओं के प्रजनन के कारण किया गया है। अग्नाशय की क्षति की गंभीरता का आकलन संक्रमित पित्त एसिड की एकाग्रता, गति और मात्रा को मापकर किया जा सकता है। यह अध्ययन प्रोटोकॉल प्रजनन में उपयोग की जाने वाली सामग्रियों और विधियों की एक अद्यतन चेकलिस्ट प्रदान करता है और इस तीव्र अग्नाशयशोथ (एपी) मॉडल के मुख्य परिणामों को दिखाता है। पिछले प्रकाशनों में से अधिकांश ने चूहों में इस मॉडल को पुन: प्रस्तुत करने के लिए खुद को सीमित कर लिया है। हमने चूहों में इस विधि को लागू किया है, जो अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है (यानी, चूहों के आनुवंशिक रूप से संशोधित उपभेदों के साथ काम करने की संभावना के साथ-साथ इन जानवरों के लिए अभिकर्मकों और एंटीबॉडी के शस्त्रागार की उपलब्धता) जो अध्ययन के लिए प्रासंगिक हो सकता है। चूहों में तीव्र अग्नाशयशोथ प्रेरण के लिए, हम एक व्यवस्थित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जिसमें C57BL / 6 चूहों में 3 मिनट के लिए जलसेक गति 10 μL / मिनट पर 2.5% सोडियम टॉरोकोलेट की परिभाषित खुराक होती है जो प्रेरण के 12 घंटे के भीतर गंभीरता के अपने अधिकतम स्तर तक पहुंचती है और परिणामों के साथ परिणामों को उजागर करती है जो विधि को मान्य करती है। अभ्यास और तकनीक के साथ, कुल अनुमानित समय, संज्ञाहरण के प्रेरण से जलसेक के पूरा होने तक, प्रति जानवर 25 मिनट है।
Introduction
मनुष्यों में, पित्त पथरी की उपस्थिति कोलेडोकल के टर्मिनल भाग की बाधा के कारण अग्नाशयशोथ का सबसे आम कारण है, अग्नाशय के स्राव के प्रवाह को बाधित करती है और अग्न्याशय में एक तीव्र भड़काऊ प्रक्रिया का कारण बनती है, सीरम और भड़काऊ मध्यस्थों में पाचन एंजाइमों की एकाग्रता में वृद्धि के साथ1,2।
तीव्र अग्नाशयशोथ (एपी) के विकास की व्याख्या करने के लिए दो अलग-अलग सिद्धांतों का प्रस्ताव किया गया है। “सामान्य चैनल” सिद्धांत से पता चलता है कि पित्ताशय की थैली में मौजूद पत्थर डिस्टल सामान्य पित्त नलिका प्रणाली को बाधित करते हैं, जिससे पित्त स्राव अग्नाशयी वाहिनी में प्रतिगामी प्रवाहित हो जाता है। दूसरा सिद्धांत (“डक्ट बाधा” सिद्धांत) से पता चलता है कि अतिरिक्त पित्त पथरी द्वारा अग्नाशयी वाहिनी की रुकावट ग्रहणी में अग्नाशय के स्राव के प्रवाह में रुकावट का कारण बनती है, जिससे डक्टल हाइपरटेंशन 3 होता है। यद्यपि तीव्र पित्त अग्नाशयशोथ का कारण बनने वाले तंत्र पूरी तरह से समझ में नहीं आते हैं, परिणाम एक तीव्र भड़काऊ प्रक्रिया है। पाचन एंजाइम विस्फोट और अग्न्याशय आत्म-पाचन हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों का कारण बनता है, एसिटिक तरल पदार्थ और सीरम में भड़काऊ साइटोकिन्स (आईएल -1 π, आईएल -6, टीएनएफ-α) में वृद्धि, और तीव्र चरण प्रोटीन 4,5,6 में वृद्धि।
गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ एक ऐसी स्थिति है जो कई अंगों की भागीदारी और एक उच्च मृत्यु दर जोखिम के कारण नैदानिक ध्यान देने योग्य है। तीव्र अग्नाशयशोथ (एपी) के प्रजनन के लिए पशु मॉडल महत्वपूर्ण हैं क्योंकि ये रोग के pathophysiological तंत्र की व्याख्या करते हैं और बीमारी के प्रारंभिक चरणों से शुरू होने वाली भड़काऊ घटनाओं के विकास की निगरानी करने में मदद करते हैं। यह आमतौर पर क्लिनिक 2,7 में संभव नहीं है। इसके अलावा, अग्नाशय के ऊतकों तक पहुंच प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में आसान है, जो आइसोजेनिक प्रजातियों के साथ काम करने की संभावना के साथ-साथ नैदानिक स्थितियों से जुड़े परिवर्तनों की व्याख्या के पक्ष में है, अवांछनीय चर को खत्म कर रही है, और मानव स्थिति में देखे गए परिणामों के साथ नैदानिक समानता को प्रतिबिंबित करती है।
चूहों और चूहों की प्रजातियों में तीव्र अग्नाशयशोथ के प्रेरण के लिए पित्त और गैर-पित्त मॉडल का अक्सर वैज्ञानिक साहित्य में अध्ययन किया गया है। प्रेरण के गैर-पित्त विधियों में कोलेसिस्टोकिन स्रावितागॉग या इसके एनालॉग सेरूलिन 10 की सुपरमैक्सिमल उत्तेजक खुराक का प्रशासन शामिल है; एल-आर्जिनिन की लगभग घातक खुराक का प्रशासन; या एथिओनिन 11 के साथ पूरक एक कोलीन-कमी वाले आहार का प्रशासन। यद्यपि इन तरीकों को पुन: उत्पन्न करना आसान है और इसके परिणामस्वरूप अग्नाशय की सूजन होती है, वे उन तंत्रों को दोहराते नहीं हैं जो सिद्धांत रूप में एपी को ट्रिगर करते हैं (यानी, अग्नाशय की नली में पित्त स्राव का भाटा)। पित्त मॉडल को संबोधित करने वाली तकनीक अग्नाशयी वाहिनी में पित्त एसिड के प्रतिगामी जलसेक पर आधारित है और इस प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए अच्छी तरह से प्रशिक्षित शोधकर्ताओं की आवश्यकता होती है। चूहों में इस विधि का उपयोग करके कई अध्ययन प्रकाशित किए गए हैं (जाहिरा तौर पर तकनीकी कारणों से क्योंकि इन प्रयोगों में सर्जिकल प्रक्रियाएं शामिल हैं)12,13। हालांकि, चूहों में दृष्टिकोण सूजन 3,14,15 के अध्ययन में अधिक दिलचस्प परिणाम प्रदान कर सकता है। इस अध्ययन में, हम C57BL/6 anesthetized चूहों में सोडियम टॉरोकोलेट के जलसेक द्वारा गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ के प्रजनन के लिए पालन किए जाने वाले चरणों की एक चेकलिस्ट दिखाएंगे।
उन कार्यों के लिए जिनमें एंटीबॉडी के साथ प्रयोगों की आवश्यकता और जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण की आवश्यकता शामिल है, चूहों का उपयोग इन जानवरों के लिए सामग्री के अधिक से अधिक शस्त्रागार और आइसोजेनिक और नॉकआउट प्रजातियों के साथ काम करने की संभावना के कारण बेहतर है, दूसरों के बीच जो अध्ययन के लिए प्रासंगिक उपयोग किया जा सकता है16। चूहों C57BL /6 मूल रूप से एंटीट्यूमर गतिविधि और इम्यूनोलॉजी के अध्ययन के लिए विकसित चूहों का एक inbred तनाव है। इस तनाव को शोधकर्ताओं द्वारा आइसोजेनिक होने के लिए तेजी से पसंद किया जा रहा है, जिससे परिणामों की अधिक पुनरुत्पादकता की अनुमति मिलती है, जो एक प्रयोग में जानवरों की एक छोटी संख्या के उपयोग और एक ही समूह 17,18 के बीच परिणामों की कम परिवर्तनशीलता का संकेत दे सकती है।
Perides et al. (2010)14 ने सोडियम टॉरोकोलेट जलसेक द्वारा चूहों में एपी प्रेरण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रकाशित किया। यहां हम C57BL / 6 चूहों में एक उच्च सोडियम टॉरोकोलेट एकाग्रता (2.5%) का उपयोग करके इस मॉडल को अपडेट करते हैं, जिसमें एक परिभाषित मात्रा और जलसेक की गति (चित्रा 1) होती है। गंभीरता का अधिकतम स्तर चूहों में प्रेरण के 12 घंटे के भीतर पहुंच गया है। सीरम और पेरिटोनियल गुहा दोनों में आईएल -6 की एकाग्रता की ऊंचाई एपी की प्रगति के साथ सहसंबद्ध है। अभ्यास के साथ, जलसेक के पूरा होने के लिए संज्ञाहरण के प्रेरण से कुल अनुमानित समय, प्रति जानवर 25 मिनट है। यह आवश्यक है कि एक प्रशिक्षित शोधकर्ता इस प्रयोग का संचालन करे। यह सुनिश्चित करने के लिए कि समाधान को आम पित्त नलिका में ठीक से इंजेक्ट किया गया है, सोडियम टॉरोकोलेट के बजाय मेथिलीन ब्लू का उपयोग करके कई पायलट प्रशिक्षण सत्र करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रतिगामी सोडियम टॉरोकोलेट जलसेक द्वारा तीव्र अग्नाशयशोथ को प्रेरित करने की विधि पहले से ही चूहों 22,23,24 में दिखाई गई है। 2008, 2010 और 2015 में प्रकाशित तीन समान कार्यों ने प्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों साओ पाउलो विश्वविद्यालय के मेडिकल क्लिनिक में स्नातकोत्तर कार्यक्रम के लिए धन्यवाद; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) और साओ पाउलो मेडिकल स्कूल (FMUSP) के विश्वविद्यालय।
Materials
| 0.4 mm needle | INTRAG MEDICAL TECH | 90183210 | 30G |
| 0.54 mm polyethylene tube | Tygon | 730010 | – |
| Styrofoam block | – | – | – |
| masking tape for mounting the mouse | Missner | 1236 | – |
| Infusion pump scheduled to 10µL / min. | Havard aparatus-Peristaltic Pump Series | MA1 55-7766 | Model 66 Small Peristaltic |
| Scissors and forceps | |||
| Antiseptic providine iodine | Pfizer | 12086OR | antisepsis |
| 70% ethanol | SIGMA | 459836 | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O |
| Razor blade | Lord | bdk9a1ghk6 | For trichotomy |
| Sodium taurocholate | Sigma-Aldrich | 86339- 1G | CAS NUMBER- 345909-26-4 |
| microvessel clip | Medicon Surgical | 56.87.35 | Approximator, opening 4.0 mm, closing pressure 30 - 40 g |
| 6-0 prolene | Bioline | 5162 | Suture line |
| Ketamin NP (cloridrato de dextrocetamina) 50mg/mL | Cristália | ||
| Xilazine 2% | Syntec | ||
| Sterile saline solution (0.9% (wt/vol) saline) | Farmace | 105851 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich Chemicals | M5528 | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel – Immunology Multiplex Assay | MERCK | MCYTOMAG-70K | Simultaneously analyze multiple cytokine and chemokine biomarkers with Bead-Based Multiplex Assays using the Luminex technology, in mouse serum, plasma and cell culture samples. |
| Amylase Assay | Labtest | 11 | |
| Desmarres retractor 13-mm width |
ROBOZ | RS-6672 |
References
- Li, X., et al. Significantly different clinical features between hypertriglyceridemia and biliary acute pancreatitis: A retrospective study of 730 patients from a tertiary center. BMC Gastroenterology. 18 (1), 1-8 (2018).
- Rechreche, H., Abbes, A., Iovanna, J. L. Induction of antioxidant mechanisms in lung during experimental pancreatitis in rats. Indian Journal of Experimental Biology. 58 (5), 297-305 (2020).
- T, L., et al. Intraductal infusion of taurocholate followed by distal common bile duct ligation leads to a severe necrotic model of pancreatitis in mice. Pancreas. 44 (3), (2015).
- Botoi, G., Andercou, A. Interleukin 17-prognostic marker of severe acute pancreatitis. Chirurgia. 104 (4), 431-438 (2009).
- Li, D., Li, J., Wang, L., Zhang, Q. Association between IL-1beta, IL-8, and IL-10 polymorphisms and risk of acute pancreatitis. Genetics and Molecular Research. 14 (2), 6635-6641 (2015).
- Feng, C., et al. Effect of peritoneal lavage with ulinastatin on the expression of NF-kappaB and TNF-alpha in multiple organs of rats with severe acute pancreatitis. Experimental and Therapeutic Medicine. 10 (6), 2029-2034 (2015).
- Fang, D. Z., et al. Effects of sildenafil on inflammatory injury of the lung in sodium taurocholate-induced severe acute pancreatitis rats. International Immunopharmacology. 80, (2020).
- Ceranowicz, P., Cieszkowski, J., Warzecha, Z., Dembinski, A. Experimental models of acute pancreatitis. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej(Online). 69, 264-269 (2015).
- Wan, M. H., et al. Review of experimental animal models of biliary acute pancreatitis and recent advances in basic research. HPB (Oxford). 14 (2), 73-81 (2012).
- Mayerle, J., Sendler, M., Lerch, M. M. Secretagogue (Caerulein) induced pancreatitis in rodents. Pancreapedia: The Exocrine Pancreas Knowledge Base. (1), (2013).
- Wang, N., et al. Resveratrol protects against L-arginine-induced acute necrotizing pancreatitis in mice by enhancing SIRT1-mediated deacetylation of p53 and heat shock factor 1. International Journal of Molecular Medicine. 40 (2), 427-437 (2017).
- Ma, Z. H., et al. Effect of resveratrol on peritoneal macrophages in rats with severe acute pancreatitis. Inflammation Research. 54 (12), 522-527 (2005).
- Souza, L. J., et al. Anti-inflammatory effects of peritoneal lavage in acute pancreatitis. Pancreas. 39 (8), 1180-1184 (2010).
- Perides, G., Acker, G. J. v., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
- Wittel, U. A., et al. Taurocholate-induced pancreatitis: a model of severe necrotizing pancreatitis in mice. Pancreas. 36 (2), 9-21 (2008).
- Tao, L., Reese, T. A. Making mouse models that reflect human immune responses. Trends Immunology. 38 (3), 181-193 (2017).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Science. 6 (1), 2-9 (2014).
- Song, H. K., Hwang, D. Y. Use of C57BL/6N mice on the variety of immunological researches. Laboratory Animal Research. 33 (2), 119-123 (2017).
- Bogdanske, J. J., Stelle, S. H. -. V., Riley, M. V., Schiffman, B. M. . Suturing Principles and Techniques in Laboratory Animal Surgery. 1st edition. (1), (2010).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).
- Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Annals of Surgery. 215 (1), 44-56 (1992).
- Liu, D. L., et al. Resveratrol improves the therapeutic efficacy of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in rats with severe acute pancreatitis. International Immunopharmacology. 80, 106128 (2020).
- Yang, X. F., et al. Chaiqin chengqi decoction alleviates severe acute pancreatitis associated acute kidney injury by inhibiting endoplasmic reticulum stress and subsequent apoptosis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 125 (12), 110024 (2020).
- Yang, X. F., et al. Chaiqin chengqi decoction alleviates severe acute pancreatitis associated acute kidney injury by inhibiting endoplasmic reticulum stress and subsequent apoptosis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 125, 110024 (2020).
- Venglovecz, V., Z, R., Hegyi, P. The effects of bile acids on pancreatic ductal cells. Pancreapedia: The Exocrine Pancreas Knowledge Base. (1), (2019).
- Roberts, S. E., Akbari, A., Thorne, K., Atkinson, M., Evans, P. A. The incidence of acute pancreatitis: impact of social deprivation, alcohol consumption, seasonal and demographic factors. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 38 (5), 539-548 (2013).
- Lerch, M. M., Gorelick, F. S. Models of acute and chronic pancreatitis. Gastroenterology. 144 (6), 1180-1193 (2013).
- Nakamura, K., Fukatsu, K., Sasayama, A., Yamaji, T. An immune-modulating formula comprising whey peptides and fermented milk improves inflammation-related remote organ injuries in diet-induced acute pancreatitis in mice. Biosci Microbiota Food Health. 37 (1), 1-8 (2018).
- Kui, B., et al. New insights into the methodolgy of L-Arginine-induced acute pancreatitis. PLoS One. 10 (2), 011758 (2015).
- Xue, J., et al. Alternatively activated macrophages promote pancreatic fibrosis in chronic pancreatitis. Nature Communication. 6, 7158 (2015).
- Lesina, M., Wormann, S. M., Neuhofer, P., Song, L., Algul, H. Interleukin-6 in inflammatory and malignant diseases of the pancreas. Seminars in Immunology. 26 (1), 80-87 (2014).
- Rao, S. A., Kunte, A. R. Interleukin-6: An early predictive marker for severity of acute pancreatitis. Indian Journal of Critical Care Medicine. 21 (7), 424-428 (2017).
