Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Funktionel vurdering af BRCA1-varianter ved hjælp af CRISPR-medierede basiseditorer

Published: February 28, 2021 doi: 10.3791/61557
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Biomedical Sciences, Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, 2Stem Cell Immunomodulation Research Center, University of Ulsan College of Medicine

Summary

Mennesker med BRCA1 mutationer har en højere risiko for at udvikle kræft, hvilket berettiger præcis evaluering af funktionen af BRCA1 varianter. Heri beskrev vi en protokol til funktionel vurdering af BRCA1-varianter ved hjælp af CRISPR-medierede cytosinbaseredaktører, der muliggør målrettet C:G til T:A-konvertering i levende celler.

Abstract

Nylige undersøgelser har undersøgt de risici, der er forbundet med BRCA1 genmutationer ved hjælp af forskellige funktionelle vurderingsmetoder såsom fluorescerende reporter assays, embryonale stamceller levedygtighed assays, og terapeutiske lægemiddel-baserede følsomhed assays. Selv om de har afklaret en masse BRCA1 varianter, disse assays involverer brug af eksogent udtrykt BRCA1 varianter er forbundet med overekspression spørgsmål og kan ikke anvendes til post-transskriptionel regulering. For at løse disse begrænsninger har vi tidligere rapporteret en metode til funktionel analyse af BRCA1-varianter via CRISPR-medieret cytosinbaseeditor, der fremkalder målrettet nukleotiderstatning i levende celler. Ved hjælp af denne metode vi identificerede varianter, hvis funktioner forbliver tvetydige, herunder c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T og c.4986+5G>A, og bekræftede, at CRISPR-medierede basisredaktører er nyttige værktøjer til omklassificering af varianter af usikker betydning i BRCA1. Her beskriver vi en protokol til funktionel analyse af BRCA1-varianter ved hjælp af CRISPR-baseret cytosinbaseeditor. Denne protokol indeholder retningslinjer for udvælgelse af målsteder, funktionel analyse og evaluering af BRCA1-varianter.

Introduction

Brystkræft type 1 modtagelighed gen (BRCA1) er en almindeligt kendt tumor suppressor gen. Fordi BRCA1 genet er relateret til reparation af DNA-skader, mutationer i dette gen ville føre til en større risiko for kræft udvikling i en individuel1. Bryst-, æggestokkene, prostata, og kræft i bugspytkirtlen er knyttet til arvelige tab-of-funktion (LOF) mutationer af BRCA1 genet2. Funktionel vurdering og identifikation af BRCA1-varianter kan hjælpe med at forebygge og diagnosticere de forskellige sygdomme. For at løse funktionen af BRCA1 varianter, flere metoder er blevet udviklet og bredt anvendt til at undersøge patogenicitet BRCA1 varianter såsom embryonale stamceller levedygtighed assays, fluorescerende reporter assays, og terapeutisk stof-baserede følsomhed assays3,4,5,6. Selv om disse metoder har vurderet funktionen af mange BRCA1-varianter, udgør metoderne, der involverer eksogent udtrykte BRCA1-varianter, begrænsninger med hensyn til overekspression, der kan påvirke downstream-regulering, gendosering og proteinfoldning7. Desuden kan disse assays ikke udnyttes til posttranscriptional regulering såsom mRNA splejsning, udskrift stabilitet, og effekten af uoversatte region8,9.

CRISPR-Cas9-systemet muliggør målrettet genomredigering i levende celler og organismer10. Gennem en enkelt-guide RNA, cas9 kan fremkalde dobbelt-streng pauser (DSBs) i kromosomal DNA på specifikke genomiske loci med henblik på at aktivere to DNA reparation veje: fejl-tilbøjelige nonhomologous ende-sammenføjning (NHEJ) vej og fejlfri homologi-rettet reparation (HDR) vej11. HDR er en præcis reparationsmekanisme; DSB'er, der er induceret af Cas9-kerner til HDR, resulterer dog ofte i uønsket indsættelse og sletning (indel) mutation. Derudover har den brug for homologe donor-DNA-skabeloner til reparation af DNA-skader og har relativt lav effektivitet. For nylig, Cas9 nickase (nCas9) er blevet fusioneret med cytidin deaminase domæner for at målrette C: G til T: A substitutioner, uden behov for homologe DNA-skabeloner og DNA dobbelt streng pauser12,13,14,15. Ved hjælp af cytosinbaseeditoren udviklede vi en ny metode til funktionel analyse af BRCA1 varianter16.

I denne undersøgelse brugte vi CRISPR-medieret cytosin base editor, BE314, som fremkalder effektive C:G til T:A punkt mutationer, til at gennemføre den funktionelle vurdering af BRCA1 varianter og med succes identificeret funktionerne i flere BRCA1 varianter (Figur 1).

Figure 1
Figur 1: En oversigt over arbejdsgangen for funktionel vurdering. (A)Skematisk, der viser BRCA1'sfunktionelle vurdering . Fordi LOF af BRCA1 påvirker celle levedygtighed, når BRCA1 mutation er patogen, cellerne dør som passage nummer stiger. B) Stadier i den funktionelle vurdering af BRCA1. Prikket boks er valgfri. Det kan erstattes af co-transfekt af gRNA-udtryk og BE3, der udtrykker plasmids DNA. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Metode 1 (generering af HAP1-BE3-cellelinjer) er valgfri. I stedet for at konstruere en BE3-udtrykkende cellelinje, kan BE3-kodning plasmid DNA co-transfected med gRNA-kodning plasmid DNA. Andre varianter af cytosin base redaktører, såsom BE4max, også kan bruges til meget effektiv base redigering.

1. Generering af HAP1-BE3-cellelinjer

  1. Konstruktion af plasmid DNA
    1. For at konstruere lentiBE3-blast plasmid DNA til produktion af lentivirus skal BE3-kodningssekvenserne i pCMV-BE3(Table of Materials)forstærkes af PCR ved hjælp af high-fidelity polymerase. Pcr-primeren skal udformes således, at den indeholder overlappende sekvenser af den fordøjede vektor (fra trin 1.1.2) til isotermisk samling som følger17:
      primer-F: 5'-TTTGCCGCCAGAACACAGGACCGGTTCTAGA GCCGCCACCATGAGCTCAGAG-3'
      primer-R: 5'-CAGAGAGAAGTTTGTTGCGCCGGATCC GACTTTCCTTCTTCTTGGG-3'
      BEMÆRK: Nukleotider, der er vist i understreget, overlapper den fordøjede vektor, og disse sekvenser vil være specifikke for den destinationsvektor, som brugeren har valgt.
    2. Det er ensmid-DNA med restriktionsenzymerne XbaI og BamHI (1 enhed pr. 1 μg) i 1 time ved 37 °C. Kør det fordøjede produkt på en 0,8% agarose gel og rense passende størrelse bånd (8,6 kb) ved hjælp af en kommerciel gel ekstraktion kit (Tabel over materialer).
    3. Klon det forstærkede BE3 PCR-produkt og den fordøjede lentiCas9-Blast-vektor ved hjælp af isotermisk samlingssæt (Tabel over materialer). Brug i alt 0,02-0,5 pmol DNA-fragmenter og et 1:3-forhold mellem vektor:insert. Omdan samlingsproduktet til DH5 alfa-kompetente celler18. Transformanterne tilsættes på en agarplade, der indeholder ampicillin (100 μg/mL), og pladen inkuberes natten over ved 37 °C.
    4. Pick flere kolonier og pode dem i 4 mL LB (lysogeny bouillon) medium, der indeholder ampicillin (100 μg/mL) og dyrke kulturen i en rystende inkubator ved 180 rpm.
    5. Rense plasmid DNA ved hjælp af en kommerciel plasmid DNA rensning kit (Tabel over materialer) i henhold til producentens protokoller.
    6. For at bekræfte dna-kloningssuccesen skal BE3-sekvenserne for hvert renset plasmid-DNA (fra trin 1.1.5) analyseres af Sanger-sekventering ved hjælp af standard- og BE3-specifikke primere (Supplerende tabel 1) og vælge den nøjagtige klonede lentiBE3-blast-konstruktion.
      BEMÆRK: For at analysere resultaterne af Sanger-sekventering anbefalede vi flere værktøjer som BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) og CLUSTALW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw).
  2. Cellekultur og generering af HAP1-BE3 cellelinjer
    1. Opretholde celler i en sund tilstand og i en aktivt dividere tilstand. Kultur HAP1 celler i Iskoves modificerede Dulbecco's medium (Tabel over materialer), der indeholder 10% føtal kvæg serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin. Kultur HEK293T/17 celler i Dulbecco's modificerede Eagle's medium (Tabel over materialer), der indeholder 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin.
      BEMÆRK: HAP1 celle er nyttig for genetisk forskning på grund af det er næsten haploid celler. Cellerne kan dog spontant vende tilbage til en diploid tilstand i cellekultur. Berigelse Hoechst 34580 farvede 1n-befolkningved hjælp af flowcytometry vil være nyttigt for vedligeholdelse af haploidy af HAP1 celler19.
    2. Seed 5 x 106 HEK293T/17 celler på en 100 nm parabol 1 dag før transfekt. På dagen for transfekten overføres plasmid-DNA'et (15 μg lentiBE3-blast, 9 μg psPAX2 til viral emballage og 6 μg pMD2.G til hætteglaskonvolut af2. generations lentiviralt emballeringssystem) ved hjælp af kommercielle transfektreagenser i henhold til producentens protokoller (Tabel over materialer)20. Skift medium ved 6 timer post-transfekt og høst virus-holdige medium på 48 timer eller 72 timer efter transfekt. Supernatanten filtreres med et filter på 0,45 μm.
    3. Transduce de lentivirale partikler af BE3 i HAP1 celler på en MOI (mangfoldighed af infektion) på 0,1. For at justere for en passende MOI skal du bruge serielt fortyndede koncentrationer af virus. Fjern mediet og udskift det med justeret viral supernatant og frisk kultur medium.
    4. En dag efter transduktionen skal mediet ændres til 10 μg/mL blasticidin (Tabel over materialer) og de transducerede celler vælges i 3 dage med blasticidin. Efter blasticidin udvælgelse, skal du vælge en brønd med ~ 10% af de overlevende celler til næste trin.
    5. Efter valg af blasticidin frøes de transducerede celler på 96-brøndsplader med en massefylde på 0,5 celler/brønd for at isolere enkelte kloner (f.eks. fortyndes 50 celler i 20 mL (0,5 celler pr. 200 μL) kulturmedium og aliquot 200 μL pr. brønd i 96 brøndplader). Inkuber 96-brøndspladerne i 2 uger, og vælg de enkelte kolonier for at bekræfte BE3-aktiviteten.
    6. Del de enkelte kolonier i to sæt, et sæt til test af BE3-aktivitet og et andet til vedligeholdelse. Transduce de lentivirale partikler af gRNA'er til et af sættene for at bekræfte BE3-aktiviteten. Analysere mutationsfrekvensen for hver koloni ved hjælp af T7 endonuklease I (T7E1, Table of Materials) analyse eller ved at udføre den målrettede dybe sekventeringsteknik (trin 4)21. Vælg passende enkelte kloner, der er sunde og har en meget aktiv BE3.
      BEMÆRK: For at validere nøjagtige mutationsfrekvenser anbefaler vi den målrettede dybe sekventering end T7E1-analyse. HEK2 (5'-GAACACAAAGCATAGACTGCGGG-'3) er godt valideret mål site for BE3.

2. Design og konstruktion af BRCA1 rettet mod gRNA'er

Figure 2
Figur 2: Et eksempel på et gRNA plasmid DNA. (A) For effektivt at redigere målsekvensen med BE3 kræves en NGG PAM (CCN PAM), der placerer mål C (mål G) i et fem-nukleotidvindue. NGG PAM vises med rødt, og basisredigeringsvinduet repræsenteres af en grå boks. (B) GRNA-sekvensen for c.8047C>T-basisredigering (H1283Y) er angivet, og mål C:G-par vises med rødt, mens det aktive vindue fremhæves med en grå boks. Ved gRNA-kloning tilsættes de udhængssekvenser, der er angivet med fed skrift, i begge 5ʹ ender. Skabeloner til gRNA blev genereret ved at udgløde de to komplementære oligonukleotider. Klik her for at se en større version af dette tal.

BEMÆRK: Positiv og negativ kontrol af BRCA1 varianter er afgørende. I denne undersøgelse anvendes c.5252G>A (R1751Q) og c.4527C>T (Y1509Y) som godartede kontroller. c.191G>A (C64Y), 81-1G>A og c.3598C>T (Q1200*) anvendes som patogene kontroller. Målsekvenser for hvert gRNA er anført i supplerende tabel 1.

  1. Få BRCA1-genomsekvensen fra GenBank på NCBI22.
  2. Søg i 20-bp målsteder med Protospacer Tilstødende Motiv (PAM) sekvens "NGG" og "CCN" omkring mutation af interesse. Mutationen af interesse bør være placeret i 4-8 nukleotider i PAM-distale ende af gRNA-målsekvenserne på grund af det aktive vindue i BE3 er 4-8 nukleotider i PAM-distalenden af gRNA-målsekvenserne14. For så vidt angår c.8047C>T (H1283Y)- og c.5252G>A (R1751Q)-målretning gRNAs, 5ʹ-TCAGGAACATCACCTTAGTG-AGG-3ʹ og 5ʹ-CCA-CCAAGGTCCAAAGCGAGCAA-3ʹ, sekvenserne med fed skrift er aktive vinduer. C til T- og G til A-konverteringer sker med henholdsvis NGG og CCN PAM (figur 2A).
    BEMÆRK: BE-Designer (http://www.rgenome.net/be-designer/)23 er nyttige webbaserede værktøjer til gRNA-design.
  3. Bestil to komplementære oligonukleotider pr. gRNA; for de forreste oligonukleotider tilsættes "CACCG" til den 5ʹ ende af føringssekvensen, og for de omvendte oligonukleotider tilsættes "AAAC" til 5' ende og "C" til 3' enden. Disse yderligere sekvenser er specifikke for den destination gRNA-udtrykvektor (fra trin 2.5), der bruges til denne protokol, og brugerne skal justeres for alternative gRNA-udtrykvektorer (Figur 2B).
  4. Oligonukleotid i destilleret vand i en endelig koncentration på 100 μM. Bland de to komplementære oligonukleotider til en endelig koncentration på 10 μM med T4 Ligation buffer (Tabel over materialer) og varm dem ved 95 °C i 5 minutter og afkøl dem ved stuetemperatur til udglødning.
  5. PRG2 fordøjes ved hjælp af restriktionsenzymet BsaI (1 enhed pr. 1 μg) i 1 time ved 37 °C (Materialetabel). Kør det fordøjede produkt på 1% agarosegel og rens det passende bånd (2,5 kb).
    BEMÆRK: I stedet for at bruge en klassisk fordøjelses- og ligationsmetode, kan der anvendes anden kloningsmetode som Golden Gate-kloning.
  6. Ligate den udglødede oligonukleotid duplex til vektor DNA ved hjælp af den købte DNA ligase (Tabel over materialer) i henhold til producentens protokol og omdanne dem til DH5 alfa-kompetente celler (Andre E. coli stammer, som i vid udstrækning anvendes til subkloning også kan anvendes).
  7. Transformanterne tilsættes til en agarplade, der indeholder ampicillin (100 μg/mL), og pladen inkuberes natten over ved 37 °C. Rense plasmid DNA fra flere transformanter og analysere deres gRNA sekvenser af Sanger sekventering ved hjælp af primere, som primer på U6 promotor (Table of Materials).

3. Oprettelse af BRCA1-varianter ved hjælp af CRISPR-medierede basisredigeringsværktøjer

BEMÆRK: Hvis DER ikke anvendes HAP1-BE3-cellelinjer, kan BE3-kodningsplasmid-DNA co-transfected med BRCA1-targeting gRNA. Sammenlignet med co-transfection af BE3 og gRNA plasmider, transfekt af gRNA plasmid til HAP-BE3 celler fremkalde effektiv base redigering op til 3 gange på mål locus i vores hænder.

  1. Frø 5 x 105 HAP1-BE3 celler (eller HAP1 celler i tilfælde af co-transfekt metoder) per brønd i 24-brønds plader 1 dag før overføring. På tidspunktet for transfekten, kulturceller for at nå en passende tæthed (70%-80% sammenløb).
  2. Transfect BRCA1-målretning gRNA'er ved hjælp af de købte transfekture reagenser (Tabel over materialer) i henhold til producentens protokol. Brug 1 μg BRCA1-målretning gRNA'er (med 1 μg BE3-kodning plasmid DNA i tilfælde af co-transfection metoder) til at fremkalde C:G til T:A konvertering på BRCA1 målsteder. Cellerne inkuberes ved 37 °C og subkultur hver 3-4.
  3. Høst cellepillerne 3, 10 og 24 dage efter transfekten for at analysere basisredigeringseffektivitet (Prøver fra 3 dage efter transfekt analyseres regradering som dag 0 prøver).
  4. Udtræk genomisk DNA ved hjælp af det genomiske DNA-rensesæt (Tabel over materialer).
    BEMÆRK: Vi anbefaler, at du optimerer transfektbetingelserne med variabelt forhold mellem reagens og DNA. Optimal betingelse for HAP1 transinfektion er 4:1 ration af reagens til DNA i vores hænder.

4. Prøveforberedelse til Illumina næste generations sekventering (NGS)

Figure 3
Figur 3: Forberedelse til næste generations sekventering. 1. PCR primer er designet til at forstærke BRCA1-målstedet på genomisk DNA. 2nd PCR primer blev designet således, at dens sekvenser er placeret mere inde end 1st PCR primer sekvenser. Yderligere sekvenser vist som en gul bjælke blev tilføjet i begge ender af 2nd PCR primer at vedhæfte de væsentlige sekvenser for at udføre næste generation sekventering. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Design de1. PCR-primere for at forstærke BRCA1-målsteder. Selvom der ikke er nogen begrænsning på størrelsen af det1. PCR-produkt, anbefales det, at en produktstørrelse på <1 kb effektivt forstærker et bestemt område (figur 3).
  2. Design de 2nd PCR primere, der er placeret inde i1. PCR-produkt. Overvej størrelsen af amplicon i henhold til NGS læse længde (For eksempel bør størrelsen af amplicon produkt være mindre end 300 bp for 2 × 150 bp parret-end køre for at fusionere hver læser). For at vedlægge væsentlige sekvenser til NGS-analyse tilsættes yderligere sekvenser til 5' slutningen af2. tilføj 5'-ACACTCTTTCCCTACGACGCTCTTCCGATCT-3'-sekvenser til 5'-enden, og tilføj 5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCG ATCT-3'-sekvenser til 5'-enden for de omvendte primere.
    BEMÆRK: Vi brugte indlejret PCR til at reducere amplicon af ikke-specifik binding ved at forhindre primere i at knytte til ikke-målsekvens.
  3. Forstærk BRCA1-målstederne på det genomiske DNA, der er opnået fra tre tidspunkter. Brug high-fidelity polymerase i henhold til producentens protokol for at minimere PCR-fejl. Til1. PCR-reaktion skal du bruge 100 ng genomisk DNA til forstærkning over 15 cyklusser. Til 2nd PCR-reaktionen anvendes 1 μL af det1. Kør 5 μL af 2nd PCR-produktet på 2% agarosegel, og bekræft størrelsen.
  4. For at vedlægge de væsentlige sekvenser til NGS-analyse skal du forstærke 2nd PCR-produktet ved hjælp af de primere, der er anført nedenfor. Til PCR-reaktionen anvendes 1 μL af 2nd PCR-produktet til forstærkning op til 30 cyklusser ved hjælp af high-fidelity polymerase.
    1. Hvis du vil udføre multiplexsekvensering for et stort antal biblioteker, der skal grupperes og sekvenseres samtidigt, skal du bruge fremadgående (D501 – D508) og omvendte (D701 – D712) primere, som har en entydig indekssekvens (Supplerende tabel 1). Forstærk hver prøve ved hjælp af forskellige primere sæt til at gennemføre den unikke dobbelte indekseringsstrategi.
    2. Kør 5 μL pcr-produktet på 2% agarosegel for at bekræfte størrelsen, og rens ampliconen ved hjælp af et kommercielt PCR-oprydningssæt (Tabel over materialer). Bland hvert eksempel i lige store mængder for at oprette et NGS-bibliotek.
  5. Ngs-biblioteket kvantificeres med en bølgelængde på 260 nm ved hjælp af spektrofotometre, og NGS-biblioteket fortyndes til en koncentration på 1 nM ved hjælp af resuspensionsbuffer eller 10 mM Tris-HCl, pH 8.5. Forbered 100 μL af biblioteket fortyndet til den passende belastningskoncentration afhængigt af bibliotekstyperne (for eksempel forberede 200 pM af biblioteket til Nextera DNA Flex).
    1. Som kontrol skal phiX kombineres med den fortyndede prøve, der passer til kittypen.
    2. Indlæs biblioteket på patronen, og kør NGS i henhold til producentens protokol. Illumina iSeq 100- eller Miseq-systemer kan sekvensere ampliconer af forskellig længde op til 300 bp for enkeltlæst eller parret ende. Vi anbefalede over 10.000 læsninger pr. mål amplicon til dybdegående analyse af basisredigeringseffektivitet.

5. Analyse af basisredigeringseffektivitet til funktionel vurdering af BRCA1-varianter

  1. Analyser basisredigeringseffektiviteten ved hjælp af MAUND24. Basisredigeringseffektiviteten beregnes som beskrevet nedenfor.
    Equation 1
    Hvis der findes flere cytosiner i det aktive BE3-vindue, tages kun den C til T-konvertering, der er målrettet mod evaluering af BRCA1-varianten, i betragtning. For eksempel, hvis sekvenserne af BE3 aktive vindue er "C4A5T6C7T8,"de mulige sekvenser genereret af base redigering er "T4A5T6C7T8", "C4A5T6T7T8",og "T4A5T6T7T8". På dette tidspunkt, hvis position 4 er den målrettede position for den ønskede BRCA1-variant, overvejes kun sekvensen ""T4A5T6C7T8"til beregning af basisredigeringseffektivitet.
    BEMÆRK: Vi anbefaler også andre webværktøjer til analyse af basisredigeringsaktivitet som CRISPResso225og BE-analyzer23.
  2. Kontroller resultaterne ved hjælp af positive og negative kontroller af BRCA1-varianter. Basisredigeringseffektiviteten af den godartede kontrol bør forblive den samme, mens den patogene kontrol bør falde over tid.
  3. Beregn brca1-varianternes relative basisredigeringseffektivitet, og bestem deres patogeneitet. De betydelige forskelle mellem dag 0- og dag 21-prøver analyseres passende statistisk analyse, f.eks.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De eksperimentelle tilgange, der er beskrevet i denne protokol, muliggør funktionel vurdering af endogene BRCA1-varianter genereret af CRISPR-baserede cytosinbaseredaktører. For at vælge passende cellelinjer til funktionel vurdering af BRCA1-varianter bør forskere bekræfte, at BRCA1 er vigtigt gen i de målrettede cellelinjer. For eksempel transfected vi først Cas9 og gRNA'er til HAP1-cellelinjer for at forstyrre BRCA1 og analyserede mutationsfrekvenser ved målrettet dyb sekventering. Vi fandt, at mutationsfrekvenser faldt betydeligt over tid i HAP1-cellelinjer (Figur 4A). Disse resultater viste, at BRCA1 er afgørende gen for celle levedygtighed i HAP1 cellelinjer. For at undersøge, om C:G til T:A substituerede varianter påvirker funktionen af BRCA1, blev plasmids DNA-kodnings-gRNA'er, som kunne fremkalde hver mutation, transfected til HAP1-BE3 cellelinjer, og substitutionsfrekvenserne blev analyseret. De relative substitutionsfrekvenser for c.3598C>T (s. Q1200*), en patogen variant, faldt dramatisk, mens frekvenserne på ca. 4527C>T (s.Y1509Y), en godartet variant, forblev ens med tiden (Figur 4B). I ClinVar-databasen rapporteres c.154C>T (s. L52F), c.3847C>T (p.H1283Y) og c.5056C>T (p.H1686Y) af BRCA1 som varianter af usikker betydning. Vi analyserede funktionen af disse varianter ved hjælp af ovennævnte metoder og fandt, at nukleotidserstatningsfrekvenser af disse tre varianter faldt på en tidsafhængig måde (Figur 4B). Ud fra disse resultater ændrede de tre substitutioner BRCA1-funktionen og kunne kategoriseres som patogene mutationer.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative resultater af funktionel undersøgelse af BRCA1 ved hjælp af CRISPR-Cas9-systemer. (A) BRCA1-forstyrrelser påvirker cellens levedygtighed. HAP1 celler blev transfected med plasmid kodning spCas9 og to gRNA rettet mod BRCA1, henholdsvis, og målrettet dyb sekventering blev udført for celle levedygtighed analyse. Mutationsfrekvenser af BRCA1 faldt på en tidsafhængig måde i celler, der blev transfected med to uafhængige gRNA'er, og mutationsfrekvenserne for CCR5, som blev brugt som en negativ kontrol, forblev de samme over tid. (B) Funktionelle vurderinger af fem BRCA1-varianter. HAP1-BE3 celler blev transfected med gRNA'er inducere BRCA1 mutationer, henholdsvis, og målrettet dyb sekventering blev udført for celle levedygtighed analyse. De relative substitutionsfrekvenser faldt på en tidsafhængig måde i celler af c.3598C>T, c.154C>T, c.3847C>T og c.5056C>T og c.4527C>T forblev de samme. Fejllinjer viser middelværdiens standardfejl. Stjerner angiver forskellige P-værdier: * P<0,05; ** P<0.005., n.s: ikke signifikant. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver en enkel metode til funktionelle vurderinger af BRCA1-varianter ved hjælp af CRISPR-mediteret cytosinbaseeditor. Protokollen beskriver metoder til udformning af gRNA'er på mål locus og konstruktion af plasmid DLA'er, hvorfra de udtrykkes. Cytosinbaseredaktører fremkalder nukleotidkonvertering i et aktivt vindue (i tilfælde af BE3, nukleotider 4-8 i PAM-distalenden af gRNA-målsekvenserne). Forskeren bør omhyggeligt vælge målsekvenser, fordi alle cytosiner i aktivt vindue kan erstatte thyminer. Som beskrevet i trin 5 skal flere cytosiner i et aktivt vindue desuden analyseres omhyggeligt for at evaluere funktionen af BRCA1-varianter.

Et af de vigtigste trin er transinfektion i målcellelinjen, som påvirker den indledende mutationsfrekvens for BRCA1 funktionelle vurderinger. For at forbedre den oprindelige mutationsfrekvens bør forskerne optimere leveringsmetoderne til cellelinjen af interesse. Som beskrevet i trin 1 er generering af BE3- udtryk af cellelinjer nyttig mulighed for at øge den oprindelige mutationsfrekvens. Vi anbefaler ikke lentiviral transduktion af gRNA i HAP1-BE3-cellerne, fordi konstituerende udtryk for BE3 og gRNA kan forårsage akkumulerende nukleotidkonvertering, og disse resultater forstyrrer den funktionelle vurdering af BRCA1-varianter.

Ud over de BE3-medierede metoder, der indføres i denne protokol, anbefales flere komplementære metoder for yderligere at udvide de funktionelle vurderinger af BRCA1-varianter. For det første er mutationsfrekvensen i den indledende prøve som beskrevet ovenfor vigtig for at opnå sikre resultater af BRCA1-varianter. For at øge basisredigeringseffektiviteten anbefales varianter af cytosinbaseredaktører, såsom BE4max. For det andet genkender BE3 mål-DNA-sekvensen gennem 5'-NGG-3' PAM-sekvenserne, hvilket er en begrænsning i at generere forskellige typer BRCA1-varianter. Nyligt udviklede Cas9-varianter med ændrede PAM-sekvenser er i dette tilfælde nyttige til at udvide målbare BRCA1-varianter 26,27,28. For det tredje fremkalder BE3 omfattende basisredigering på uønskede steder , og off-target-effekten kan påvirke funktionel vurdering af BRCA1-varianter29,30,31. For at reducere BE3's off-target-effekt bør målsteder for gRNA'er vælges omhyggeligt uden lignende sekvenser i genomet. SECURE-BE3 eller YE1, som har udviklet til at reducere uønsket baseredigering i genom og transskribering er nyttige mulighed32,33. Forth, en mætning genom redigering (SGE) metode baseret på Cas9-medieret HDR også gode muligheder for funktionel analyse af BRCA1 varianter19. Metoden har ingen begrænsning for valg af målsekvenser og nukleotidpositioner for BRCA1-varianter. HDR-baseret tilgang er imidlertid relativt mindre effektiv end basisredaktørerne og kræver desuden design og syntese af donorskabeloner14. Endelig patient afledt BRCA1 varianter omfatter forskellige vifte af mutationer såsom punkt mutationer, indsættelser, og sletninger. Af disse er punktmutationer en stor population af BRCA1-varianter, som ikke kun er C:G til T:A-konvertering, men også A:T til G:C, C:G til G:C og A:T til T:A-konverteringer. Til funktionelle vurderinger af disse typer konverteringer er CRISPR-medierede adenosinbaseredaktører og Prime Editors værdifulde muligheder34,35. Hurtigt udviklende genomteknologier vil muliggøre funktionelle vurderinger af mere forskelligartede BRCA1-varianter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Research Foundation of Korea (tilskud 2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637 og 2018R1A5A20732 til Y.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BamHI NEB R3136 Restriction enzyme
Blasticidin Thermo Fisher Scientific A1113903 Drug for selecting transduced cells
BsaI NEB R0535 Restriction enzyme
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504 Genomic DNA prep. kit
Dulbecco’s modified Eagle’s medium Gibco 11965092 Medium for HEK293T/17 cells
Fetal bovine serum Gibco 16000036 Supplemetal for cell culture
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311 Transfection reagent
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611L Gibson assembly kit
Iscove’s modified Dulbecco’s medium Gibco 12440046 Medium for HAP1 cells
lentiCas9-Blast Addgene 52962 Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027 Transfection reagent
Opti-MEM Gibco 31985070 Transfection materials
pCMV-BE3 Addgene 73021 Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140 Supplemetal for cell culture
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530SQ High-fidelity polymerase
pMD2.G Addgene 12259 Plasmids DNA for virus prep.
pRG2 Addgene 104174 gRNA cloning vector
psPAX2 Addgene 12260 Plasmids DNA for virus prep.
QIAprep Spin Miniprep kit Qiagen 27106 Plasmid DNA prep. Kit
QIAquick Gel extraction Kit Qiagen 28704 Gel extraction kit
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 PCR product prep. kit
Quick Ligation Kit NEB M2200 Ligase for gRNA cloning
T7 Endonuclease I NEB M0302 Materials for T7E1 assay
XbaI NEB R0145 Restriction enzyme

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
  2. Kuchenbaecker, K. B., et al. Risks of Breast, Ovarian, and Contralateral Breast Cancer for BRCA1 and BRCA2 Mutation Carriers. Journal of the American Medical Association. 317 (23), 2402-2416 (2017).
  3. Millot, G. A., et al. A guide for functional analysis of BRCA1 variants of uncertain significance. Human Mutation. 33 (11), 1526-1537 (2012).
  4. Santos, C., et al. Pathogenicity evaluation of BRCA1 and BRCA2 unclassified variants identified in Portuguese breast/ovarian cancer families. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (3), 324-334 (2014).
  5. Starita, L. M., et al. A Multiplex Homology-Directed DNA Repair Assay Reveals the Impact of More Than 1,000 BRCA1 Missense Substitution Variants on Protein Function. American Journal of Human Genetics. 103 (4), 498-508 (2018).
  6. Anantha, R. W., et al. Functional and mutational landscapes of BRCA1 for homology-directed repair and therapy resistance. Elife. 6, (2017).
  7. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  8. Quann, K., Jing, Y., Rigoutsos, I. Post-transcriptional regulation of BRCA1 through its coding sequence by the miR-15/107 group of miRNAs. Frontiers in Genetics. 6, 242 (2015).
  9. Saunus, J. M., et al. Posttranscriptional regulation of the breast cancer susceptibility gene BRCA1 by the RNA binding protein HuR. Cancer Research. 68 (22), 9469-9478 (2008).
  10. Knott1, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361, 866-869 (2018).
  11. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  12. Hess, G. T., et al. Directed evolution using dCas9-targeted somatic hypermutation in mammalian cells. Nature Methods. 13 (12), 1036-1042 (2016).
  13. Kim, K., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos. Nature Biotechnology. 35 (5), 435-437 (2017).
  14. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  15. Park, D. S., et al. Targeted Base Editing via RNA-Guided Cytidine Deaminases in Xenopus laevis Embryos. Molecules and Cells. 40 (11), 823-827 (2017).
  16. Kweon, J., et al. A CRISPR-based base-editing screen for the functional assessment of BRCA1 variants. Oncogene. 39 (1), 30-35 (2020).
  17. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
  18. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
  19. Findlay, G. M., et al. Accurate classification of BRCA1 variants with saturation genome editing. Nature. 562 (7726), 217-222 (2018).
  20. Kweon, J., Kim, D. E., Jang, A. H., Kim, Y. CRISPR/Cas-based customization of pooled CRISPR libraries. PLoS One. 13 (6), 0199473 (2018).
  21. Kim, Y., et al. A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. Nature Biotechnology. 31 (3), 251-258 (2013).
  22. Sayers, E. W., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 47 (1), 94-99 (2019).
  23. Hwang, G. H., et al. Web-based design and analysis tools for CRISPR base editing. BMC Bioinformatics. 19 (1), 542 (2018).
  24. Kim, D., Kim, D. E., Lee, G., Cho, S. I., Kim, J. S. Genome-wide target specificity of CRISPR RNA-guided adenine base editors. Nature Biotechnology. 37 (4), 430-435 (2019).
  25. Clement, K., et al. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nature Biotechnology. 37 (3), 224-226 (2019).
  26. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  27. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  28. Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. , (2020).
  29. Kim, D., et al. Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases. Nature Biotechnology. 35 (5), 475-480 (2017).
  30. Zuo, E., et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science. 364 (6437), 289-292 (2019).
  31. Jin, S., et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science. 364 (6437), 292-295 (2019).
  32. Grunewald, J., et al. Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature. 569 (7756), 433-437 (2019).
  33. Doman, J. L., Raguram, A., Newby, G. A., Liu, D. R. Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors. Nature Biotechnology. 38 (5), 620-628 (2020).
  34. Gaudelli, N. M., et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 551 (7681), 464-471 (2017).
  35. Anzalone, A. V., et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).

Tags

Kræftforskning Problem 168 CRISPR-Cas basisredigering BE3 BRCA1 funktionel vurdering Genomteknik
Funktionel vurdering af <em>BRCA1-varianter</em> ved hjælp af CRISPR-medierede basiseditorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

See, J. E., Shin, H. R., Jang, G.,… More

See, J. E., Shin, H. R., Jang, G., Kweon, J., Kim, Y. Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors. J. Vis. Exp. (168), e61557, doi:10.3791/61557 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter