Summary
Mensen met BRCA1-mutaties hebben een hoger risico op het ontwikkelen van kanker, wat een nauwkeurige evaluatie van de functie van BRCA1-varianten garandeert. Hierin beschreven we een protocol voor functionele beoordeling van BRCA1-varianten met behulp van CRISPR-gemedieerde cytosinebasiseditors die gerichte C:G naar T:A-conversie in levende cellen mogelijk maken.
Abstract
Recente studies hebben de risico's onderzocht die gepaard gaan met BRCA1-genmutaties met behulp van verschillende functionele beoordelingsmethoden zoals fluorescerende reportertests, embryonale stamcel levensvatbaarheidstests en therapeutische op geneesmiddelen gebaseerde gevoeligheidstests. Hoewel ze veel BRCA1-varianten hebben verduidelijkt, worden deze tests met betrekking tot het gebruik van exogeen uitgedrukte BRCA1-varianten geassocieerd met overexpressieproblemen en kunnen ze niet worden toegepast op posttranscriptionele regelgeving. Om deze beperkingen op te lossen, rapporteerden we eerder een methode voor functionele analyse van BRCA1-varianten via CRISPR-gemedieerde cytosinebasiseditor die gerichte nucleotidesubstitutie in levende cellen induceren. Met behulp van deze methode identificeerden we varianten waarvan de functies dubbelzinnig blijven, inclusief c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T en c.4986+5G>A, en bevestigde dat CRISPR-gemedieerde basiseditors nuttige hulpmiddelen zijn voor het herindelen van de varianten van onzekere betekenis in BRCA1. Hier beschrijven we een protocol voor functionele analyse van BRCA1-varianten met behulp van CRISPR-gebaseerde cytosinebasiseditor. Dit protocol biedt richtlijnen voor de selectie van doellocaties, functionele analyse en evaluatie van BRCA1-varianten.
Introduction
Het borstkanker type 1 gevoeligheidsgen (BRCA1) is een algemeen bekend tumoronderdrukkergen. Omdat het BRCA1-gen gerelateerd is aan het herstel van DNA-schade, zouden mutaties in dit gen leiden tot een groter risico op kankerontwikkeling bij een individu1. Borst-, eierstok-, prostaat- en pancreaskankers zijn gekoppeld aan erfelijke functieverliesmutaties (LOF) van het BRCA1-gen 2. Functionele beoordeling en identificatie van BRCA1-varianten kunnen helpen bij het voorkomen en diagnosticeren van de verschillende ziekten. Om de functie van BRCA1-varianten aan te pakken, zijn verschillende methoden ontwikkeld en in grote lijnen gebruikt voor het onderzoeken van de pathogeniteit van BRCA1-varianten zoals embryonale stamcel levensvatbaarheidstests, fluorescerende reportertests en therapeutische op geneesmiddelen gebaseerde gevoeligheidstests3,4,5,6. Hoewel deze methoden de functie van veel BRCA1-varianten hebben beoordeeld, stellen de methoden met exogeen uitgedrukte BRCA1-varianten beperkingen in termen van overexpressie die van invloed kunnen zijn op downstreamregulatie, gendosering en eiwitvouwen7. Bovendien kunnen deze tests niet worden gebruikt voor de posttranscriptionele regelgeving, zoals mRNA-splicing, transcriptstabiliteit en effect van onvertaald gebied8,9.
CRISPR-Cas9-systeem maakt gerichte genoombewerking in levende cellen en organismenmogelijk 10. Via een enkelgeleid RNA kan Cas9 dubbelstrengsbreuken (DSB's) in chromosomale DNA induceren bij specifieke genomische loci om twee DNA-reparatiepaden te activeren: foutgevoelige niet-geologische end-joining (NHEJ) pathway en error-free homology-directed repair (HDR) pathway11. HDR is een nauwkeurig reparatiemechanisme; DSBs geïnduceerd door Cas9 nuclease voor HDR resulteert echter vaak in ongewenste invoeging en verwijdering (indel) mutatie. Bovendien heeft het homologe donor-DNA-sjablonen nodig voor het herstellen van DNA-schade en heeft het een relatief lage efficiëntie. Onlangs, Cas9 nickase (nCas9) zijn gesmolten met cytidine deaminase domeinen voor het richten van C:G naar T:A substituties, zonder de noodzaak van homologe DNA sjablonen en DNA dubbele streng breekt12,13,14,15. Met behulp van de cytosine base editor ontwikkelden we een nieuwe methode voor functionele analyse van BRCA1 varianten16.
In deze studie gebruikten we CRISPR-gemedieerde cytosinebasiseditor, BE314, die efficiënte C:G- tot T:A-puntmutaties induceert, voor de implementatie van de functionele beoordeling van BRCA1-varianten en identificeerden we met succes de functies van verschillende BRCA1-varianten (figuur 1).
Figuur 1: Een overzicht van de workflow voor functionele beoordeling. (A) Schematisch met de functionele beoordeling van BRCA1. Omdat het LOF van BRCA1 de levensvatbaarheid van cellen beïnvloedt, wanneer de BRCA1-mutatie pathogeen is, sterven de cellen naarmate het passagenummer toeneemt. (B) Fasen van de functionele beoordeling van BRCA1. Gestippelde doos is optioneel. Het kan worden vervangen door co-transfectie van gRNA uitdrukken en BE3 uitdrukken plasmiden DNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Methode 1 (generatie HAP1-BE3 cellijnen) is optioneel. In plaats van een BE3-uitdrukkende cellijn te construeren, kan BE3-coderend plasmide-DNA worden gecotransfecteerd met gRNA-coderend plasmide-DNA. Andere varianten van cytosine basiseditors, zoals BE4max, kunnen ook worden gebruikt voor zeer efficiënte basisbewerking.
1. Generatie hap1-BE3 cellijnen
- Constructie van plasmide DNA
- Om het lentiBE3-blast plasmide DNA te construeren voor de productie van lentivirus, versterkt u de BE3-coderingssequenties in pCMV-BE3(Tabel met materialen)door PCR met behulp van high-fidelity polymerase. Ontwerp de PCR-primer om overlappende sequenties van de verteerd vector (vanaf stap 1.1.2) voor isothermische assemblage als volgt te bevatten17:
primer-F: 5'-TTTGCCGCCAGAACACAGGACCGGTTCTAGA GCCGCCACCATGAGCTCAGAG-3",
primer-R: 5'-CAGAGAGAAGTTTGTTGCGCCGGATCC GACTTTCCTCTTCTTCTTGGG-3'
OPMERKING: Nucleotiden die in onderstreept worden weergegeven, worden overlappend met de verteerd vector en deze sequenties zijn specifiek voor de doelvector die door de gebruiker is gekozen. - Verteer lentiCas9-blast (Table of Materials) plasmide DNA met de restrictie-enzymen, XbaI en BamHI (1 eenheid per 1 μg) gedurende 1 uur bij 37 °C. Voer het verteerd product uit op een 0,8% agarosegel en zuiver de juiste banden (8,6 kb) met behulp van een commerciële gelextractiekit(Materialentabel).
- Kloon het versterkte BE3 PCR-product en de verteerde lentiCas9-Blast-vector met behulp van de isothermische assemblagekit(tabel met materialen). Gebruik in totaal 0,02-0,5 pmol DNA-fragmenten en een 1:3-verhouding van vector:insert. Zet het assemblageproduct om in DH5 alfa-competente cellen18. Voeg de transformatiemiddelen toe aan een agarplaat met ampicilline (100 μg/ml) en incubeer de plaat 's nachts bij 37 °C.
- Kies verschillende kolonies en inent ze in 4 ml LB (lysogeny bouillon) medium met ampicilline (100 μg/ml) en kweek de kweek in een schuddende incubator bij 180 tpm.
- Zuiver plasmide DNA met behulp van een commerciële plasmide DNA zuiveringskit(Tabel met materialen)volgens de protocollen van de fabrikant.
- Om het succes van dna-klonen te bevestigen, analyseert u de BE3-sequenties van elk gezuiverd plasmide-DNA (vanaf stap 1.1.5) door Sanger-sequencing met behulp van standaard- en BE3-specifieke primers (aanvullende tabel 1) en selecteert u de exacte gekloonde lentiBE3-blast-constructie.
OPMERKING: Om de resultaten van Sanger sequencing te analyseren, hebben we verschillende tools aanbevolen, zoals BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) en CLUSTALW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw).
- Om het lentiBE3-blast plasmide DNA te construeren voor de productie van lentivirus, versterkt u de BE3-coderingssequenties in pCMV-BE3(Tabel met materialen)door PCR met behulp van high-fidelity polymerase. Ontwerp de PCR-primer om overlappende sequenties van de verteerd vector (vanaf stap 1.1.2) voor isothermische assemblage als volgt te bevatten17:
- Celcultuur en generatie hap1-BE3 cellijnen
- Houd cellen in een gezonde conditie en in een actief delende toestand. Kweek HAP1 cellen in Iscove's gemodificeerde Dulbecco's medium (Tabel van Materialen) met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine. Kweek HEK293T/17 cellen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (Tabel van Materialen) met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine.
OPMERKING: HAP1-cel is nuttig voor genetisch onderzoek omdat het bijna haploïde cellen zijn. De cellen kunnen echter spontaan terugkeren naar een diploïde toestand in de celkweek. Verrijking Hoechst 34580 gebeitst 1n-populatie met behulp van flowcytometrie zal nuttig zijn voor het onderhoud van haploïdie van HAP1 cellen19. - Zaad 5 x 106 HEK293T/17 cellen op een schotel van 100 nm 1 dag voor de transfectie. Transfecteer op de dag van de transfectie het plasmide-DNA (15 μg lentiBE3-blast, 9 μg psPAX2 voor virale verpakkingen en 6 μg pMD2.G voor flacon-enveloppe van2e generatie lentiviraal verpakkingssysteem) met behulp van commerciële transfectiereagentia volgens de protocollen van de fabrikant (Tabel met materialen)20. Verander het medium bij 6 uur na de transfectie en oogst het virusbevattende medium bij 48 uur of 72 uur na de transfectie. Filter de supernatant met een filter van 0,45 μm.
- Transduceren de lentivirale deeltjes van BE3 in HAP1-cellen bij een MOI (multipliciteit van infectie) van 0,1. Gebruik serieel verdunde virusconcentraties om zich aan te passen aan een geschikte MOI. Verwijder het medium en vervang het door aangepast viraal supernatant en vers kweekmedium.
- Een dag na transductie, verander het medium in 10 μg/ml blasticidin(tabel met materialen)-bevattend medium en selecteer de transduceerde cellen gedurende 3 dagen met blasticidine. Selecteer na de blasticidinselectie een put met ~ 10% van de overlevende cellen voor de volgende stap.
- Na blasticidinselectie, zaad de getransduceerde cellen op 96-putplaten bij een dichtheid van 0,5 cellen/put om enkele klonen te isoleren (bijv. verdun 50 cellen in 20 ml (0,5 cellen per 200 μL) kweekmedium en aliquot 200 μL per put in 96 putplaat). Incubeer de 96-putplaten gedurende 2 weken en kies de enkele kolonies om de BE3-activiteit te bevestigen.
- Verdeel de enkele kolonies in twee sets, een sets voor het testen van BE3-activiteit en een andere voor onderhoud. Transduceren de lentivirale deeltjes van gRNA's in een van de sets om de BE3-activiteit te bevestigen. Analyseer de mutatiefrequentie van elke kolonie met behulp van T7 endonuclease I (T7E1, Materials Table of Materials) test of door de gerichte deep sequencing techniek uit te voeren (stap 4)21. Selecteer de juiste enkele klonen die gezond zijn en een zeer actieve BE3 hebben.
OPMERKING: Om exacte mutatiefrequenties te valideren, raden we de gerichte diepe sequencing aan dan de T7E1-test. HEK2 (5'-GAACACAAAGCATAGACTGCGGG-'3) is een goed gevalideerde doellocatie voor BE3.
- Houd cellen in een gezonde conditie en in een actief delende toestand. Kweek HAP1 cellen in Iscove's gemodificeerde Dulbecco's medium (Tabel van Materialen) met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine. Kweek HEK293T/17 cellen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (Tabel van Materialen) met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine.
2. Ontwerp en constructie van BRCA1 gericht op gRNA's
Figuur 2: Een voorbeeld van een gRNA plasmide DNA. (A) Om de doelvolgorde effectief te bewerken met BE3, is een NGG PAM (CCN PAM) vereist die het doel C (doel G) in een venster met vijf nucleotide plaatst. NGG PAM wordt rood weergegeven en het basisbewerkingsvenster wordt weergegeven door een grijs vak. (B) De gRNA-reeks voor c.8047C>T (H1283Y) basisbewerking wordt aangegeven en de doel-C:G-paren worden rood weergegeven, terwijl het actieve venster wordt gemarkeerd door een grijs vak. Voor gRNA-klonen worden de vetgedrukte overhangsequenties toegevoegd aan beide 5ʹ uiteinden. Sjablonen voor gRNA werden gegenereerd door de twee complementaire oligonucleotiden te gloeien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
OPMERKING: Positieve en negatieve controles van BRCA1-varianten zijn essentieel. In deze studie worden c.5252G>A (R1751Q) en c.4527C>T (Y1509Y) gebruikt als goedaardige controles. c.191G>A (C64Y), 81-1G>A en c.3598C>T (Q1200*) worden gebruikt als pathogene controles. Doelsequenties van elk gRNA zijn opgenomen in aanvullende tabel 1.
- Verkrijg de BRCA1 genoomsequentie van GenBank op NCBI22.
- Doorzoek de doelsites van 20 bp met de Protospacer Adjacent Motif (PAM) -reeks "NGG" en "CCN" rond mutatie van belang. De mutatie van belang moet zich bevinden in 4–8 nucleotiden in het PAM-distale uiteinde van de gRNA-doelsequenties, omdat het actieve venster van BE3 4-8 nucleotiden is in het PAM-distale uiteinde van de gRNA-doelsequenties14. In het geval van c.8047C>T (H1283Y)- en c.5252G>A (R1751Q)-targeting gRNA's, 5ʹ-TCAGGAACATCACCTTAGTG-AGG-3ʹ en 5ʹ-CCA-CCAAGGTCCAAAGCGAGCAA-3ʹ zijn de vetgedrukte sequenties actieve vensters. C naar T en G naar A conversies vinden plaats met respectievelijk NGG en CCN PAM (figuur 2A).
OPMERKING: BE-Designer (http://www.rgenome.net/be-designer/)23 is nuttige webgebaseerde tools voor gRNA-ontwerp. - Bestel twee complementaire oligonucleotiden per gRNA; voor de voorste oligonucleotiden voegt u "CACCG" toe aan het 5ʹ einde van de geleidingsreeks en voor de omgekeerde oligonucleotiden voegt u "AAAC" toe aan het 5'-uiteinde en "C" aan het 3'-uiteinde. Deze aanvullende reeksen zijn specifiek voor de doel-gRNA-expressievector (vanaf stap 2.5) die voor dit protocol wordt gebruikt, en gebruikers moeten worden aangepast voor alternatieve gRNA-expressievectoren (figuur 2B).
- Resuspendeer het oligonucleotide in gedestilleerd water bij een eindconcentratie van 100 μM. Meng de twee complementaire oligonucleotiden tot een uiteindelijke concentratie van 10 μM met T4 Ligatiebuffer (Materialentabel) en verwarm ze gedurende 5 minuten op 95 °C en koel ze bij kamertemperatuur om te gloeien.
- Verteerd pRG2 met behulp van het restrictie-enzym BsaI (1 eenheid per 1 μg) gedurende 1 uur bij 37 °C(Tabel met materialen). Voer het verteerd product uit op 1% agarosegel en zuiver de juiste maat band (2,5 kb).
OPMERKING: In plaats van een klassieke verterings- en ligatiemethode te gebruiken, kan een andere kloonmethode zoals Golden Gate-klonen worden gebruikt. - Ligateer de gegloeide oligonucleotide duplex naar het vector-DNA met behulp van de gekochte DNA-ligase (Tabel met materialen) volgens het protocol van de fabrikant en zet ze om in DH5-alfa-competente cellen (andere E. coli-stammen die veel worden gebruikt voor subcloning kunnen ook worden gebruikt).
- Voeg de transformatiemiddelen toe aan een agarplaat met ampicilline (100 μg/ml) en incubeer de plaat 's nachts bij 37 °C. Zuiver plasmide-DNA van verschillende transformanten en analyseer hun gRNA-sequenties door Sanger-sequencing met behulp van primers die primeren bij U6-promotor(Tabel met materialen).
3. Creatie van BRCA1-varianten met behulp van CRISPR-gemedieerde basisbewerkingstools
OPMERKING: Als HAP1-BE3-cellijnen niet worden gebruikt, kan BE3-coderend plasmide-DNA worden gecotransfecteerd met BRCA1-targeting gRNA. In vergelijking met co-transfectie van BE3- en gRNA-plasmiden induceren transfectie van gRNA-plasmide naar HAP-BE3-cellen efficiënte basisbewerking tot 3-voudige bij doellocus in onze handen.
- Zaad 5 x 105 HAP1-BE3 cellen (of HAP1 cellen in geval van co-transfectie methoden) per put in 24-put platen 1 dag voor de transfectie. Op het moment van transfectie, kweekcellen om een geschikte dichtheid te bereiken (70%-80% samenvloeiing).
- Transfect BRCA1-targeting gRNA's met behulp van de gekochte transfectie reagentia (Tabel van materialen) volgens het protocol van de fabrikant. Gebruik 1 μg BRCA1-targetinggRNA's (met 1 μg BE3-coderend plasmide-DNA in geval van cotransfectiemethoden) om C:G naar T:A-conversie op BRCA1-doellocaties te induceren. Incubeer de cellen bij 37 °C en subcultuur om de 3-4 dagen.
- Oogst de celkorrels 3, 10 en 24 dagen na de transfectie om de efficiëntie van basisbewerking te analyseren (monsters van 3 dagen na de transfectie worden geanalyseerd als monsters van dag 0).
- Extraheer genomisch DNA met behulp van de genomische DNA-zuiveringskit(tabel met materialen).
OPMERKING: We raden aan om transfectieomstandigheden te optimaliseren met variabele verhouding tussen reagens en DNA. Optimale conditie voor HAP1 transfectie is 4:1 rantsoen van reagens naar DNA in onze handen.
4. Monstervoorbereiding voor Illumina next-generation sequencing (NGS)
Figuur 3: Voorbereiding op sequencing van de volgende generatie. De1e PCR primer is ontworpen om de BRCA1 doellocatie op genomisch DNA te versterken. De2e PCR primer is zo ontworpen dat de sequenties zich meer binnenin bevinden dan de1e PCR primer sequenties. Aan beide uiteinden van de 2e PCR-primer werden extra sequenties als gelebalk toegevoegd om de essentiële sequenties voor het uitvoeren van sequencing van de volgende generatie te bevestigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Ontwerp de1e PCR-primers om BRCA1-doellocaties te versterken. Hoewel er geen beperking is op de grootte van het1e PCR-product, wordt een productgrootte van <1 kb aanbevolen om een specifieke regio efficiënt te versterken (figuur 3).
- Ontwerp de2e PCR primers in het1e PCR product. Overweeg de grootte van het amplicon volgens de leeslengte van de NGS (de grootte van het ampliconproduct moet bijvoorbeeld kleiner zijn dan 300 bp voor 2 × 150 bp gekoppelde uitvoering om elke leesbewerking samen te voegen). Om essentiële sequenties voor NGS-analyse te koppelen, voeg als volgt extra sequenties toe aan het 5'-uiteinde van de2e PCR-primers: voeg voor de voorwaartse primers 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'-sequenties toe aan het 5'-uiteinde en voeg voor de reverse primers 5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCG ATCT-3'-sequenties toe aan het 5'-einde.
OPMERKING: We gebruikten geneste PCR om het amplicon van niet-specifieke binding te verminderen door te voorkomen dat primers zich aan de niet-doelsequentie hechten. - Versterk de BRCA1-doellocaties op het genomische DNA verkregen uit drie tijdspunten. Gebruik high-fidelity polymerase volgens het protocol van de fabrikant voor het minimaliseren van PCR-fouten. Gebruik voor de1e PCR-reactie 100 ng genomisch DNA voor versterking gedurende 15 cycli. Gebruik voor de2e PCR-reactie 1 μL van het1e PCR-product voor versterking gedurende 20 cycli. Voer 5 μL van het2e PCR-product uit op 2% agarosegel en bevestig de grootte.
- Om de essentiële sequenties voor NGS-analyse te bevestigen, versterkt u het 2e PCR-product met behulp van de onderstaande primers. Voor de PCR-reactie wordt 1 μL van het2e PCR-product gebruikt voor versterking tot 30 cycli met behulp van high-fidelity polymerase.
- Als u multiplex-sequencing wilt uitvoeren voor grote aantallen bibliotheken die tegelijkertijd moeten worden samengevoegd en georden, gebruikt u voorwaartse (D501 – D508) en omgekeerde (D701 – D712) primers, die een unieke indexreeks hebben(aanvullende tabel 1). Versterk elk monster met behulp van verschillende primersets om de unieke dual indexing-strategie uit te voeren.
- Voer 5 μL van het PCR-product uit op 2% agarosegel om de grootte te bevestigen en de amplicon te zuiveren met behulp van een commerciële PCR-opruimset(Materialentabel). Meng elk monster in gelijke hoeveelheden om een NGS-bibliotheek te maken.
- Kwantificeer de NGS-bibliotheek op 260 nm golflengte met behulp van spectrofotometers en verdun de NGS-bibliotheek tot een concentratie van 1 nM met behulp van resuspensiebuffer of 10 mM Tris-HCl, pH 8,5. Bereid 100 μL van de bibliotheek verdund tot de juiste belastingsconcentratie, afhankelijk van de bibliotheektypen (bereid bijvoorbeeld 200 pM van de bibliotheek voor Op Nextera DNA Flex).
- Combineer phiX als controle met het verdunde monster dat geschikt is voor het type kit.
- Laad de bibliotheek op de cartridge en voer NGS uit volgens het protocol van de fabrikant. Illumina iSeq 100- of Miseq-systemen kunnen de amplicons van verschillende lengte tot 300 bp sequencen voor een enkel gelezen of gekoppeld uiteinde. We hebben meer dan 10.000 reads per doelamlicon aanbevolen voor een diepgaande analyse van de efficiëntie van basisbewerking.
5. Analyse van de efficiëntie van de basisbewerking voor de functionele beoordeling van BRCA1-varianten
- Analyseer de efficiëntie van basisbewerking met MAUND24. De basisbewerkingsefficiëntie wordt berekend zoals hieronder beschreven.
Als er meerdere cytosines aanwezig zijn in het actieve venster BE3, wordt alleen de C naar T-conversie overwogen die is gericht op het evalueren van de BRCA1-variant. Als de sequenties van het actieve venster BE3 bijvoorbeeld "C4A5T6C7T8" zijn,zijn de mogelijke sequenties die worden gegenereerd door basisbewerking "T4A5T6C7T8", "C4A5T6T7T8", en "T4A5T6T7T8". Op dit moment, als positie 4 de beoogde positie is voor de gewenste BRCA1-variant, wordt alleen de reeks ""T4A5T6C7T8" overwogen voor het berekenen van de basisbewerkingsefficiëntie.
OPMERKING: We raden ook andere webtools aan voor analyse van basisbewerkingsactiviteiten zoals CRISPResso225en BE-analyzer23. - Controleer de resultaten met behulp van positieve en negatieve controles van BRCA1-varianten. De basisbewerkingsefficiënties van de goedaardige controle moeten hetzelfde blijven, terwijl die van de pathogene controle in de loop van de tijd moeten afnemen.
- Bereken de relatieve basisbewerkingsefficiëntie van BRCA1-varianten en bepaal hun pathogeniteit. De significante verschillen tussen dag 0 en dag 21 monsters worden geanalyseerd passende statistische analyse zoals t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De experimentele benaderingen die in dit protocol worden beschreven, maken de functionele beoordeling mogelijk van endogene BRCA1-varianten die worden gegenereerd door CRISPR-gebaseerde cytosinebasiseditors. Om geschikte cellijnen te selecteren voor de functionele beoordeling van BRCA1-varianten, moeten onderzoekers bevestigen dat BRCA1 een essentieel gen is in de beoogde cellijnen. We hebben bijvoorbeeld eerst Cas9 en gRNA's omgezet in HAP1-cellijnen om BRCA1 te verstoren en mutatiefrequenties geanalyseerd door gerichte diepe sequencing. We ontdekten dat de mutatiefrequenties in de loop van de tijd aanzienlijk daalden in HAP1-cellijnen (figuur 4A). Deze resultaten toonden aan dat BRCA1 een essentieel gen is voor de levensvatbaarheid van cellen in HAP1-cellijnen. Om te onderzoeken of C:G tot T:A gesubstitueerde varianten de functie van BRCA1beïnvloeden, werden de plasmiden DNA-coderende gRNA's, die elke mutatie konden induceren, getransfecteerd naar HAP1-BE3-cellijnen en werden de substitutiefrequenties geanalyseerd. De relatieve substitutiefrequenties van c.3598C>T (p. Q1200*), een pathogene variant, daalden dramatisch, terwijl die van c.4527C>T (p.Y1509Y), een goedaardige variant, met de tijd gelijk bleven (figuur 4B). In de ClinVar-database worden c.154C>T (p. L52F), c.3847C>T (p.H1283Y) en c.5056C>T (p.H1686Y) van BRCA1 gerapporteerd als varianten van onzekere betekenis. We analyseerden de functie van deze varianten met behulp van de hierboven genoemde methoden en ontdekten dat nucleotide-substitutiefrequenties van deze drie varianten op een tijdsafhankelijke manier daalden (figuur 4B). Uit deze resultaten veranderden de drie substituties de BRCA1-functie en konden ze worden gecategoriseerd als pathogene mutaties.
Figuur 4: Representatieve resultaten van functionele studie van BRCA1 met crispr-cas9 systemen. (A) BRCA1 verstoring beïnvloedt de levensvatbaarheid van de cel. HAP1-cellen werden getransfecteerd met plasmidecodering spCas9 en twee gRNA's gericht op respectievelijk BRCA1,en gerichte diepe sequencing werd uitgevoerd voor cel levensvatbaarheidsanalyse. Mutatiefrequenties van BRCA1 daalden op een tijdsafhankelijke manier in cellen getransfecteerd met twee onafhankelijke gRNA's, en de mutatiefrequenties van CCR5, die als negatieve controle werd gebruikt, bleven na verloop van tijd hetzelfde. (B) Functionele beoordelingen van vijf BRCA1-varianten. HAP1-BE3-cellen werden getransfecteerd met gRNA's die respectievelijk BRCA1-mutaties induceerden, en gerichte diepe sequencing werd uitgevoerd voor cel levensvatbaarheidsanalyse. De relatieve substitutiefrequenties daalden op een tijdsafhankelijke manier in cellen van c.3598C>T, c.154C>T, c.3847C>T en c.5056C>T en die van c.4527C>T bleven hetzelfde. Foutbalken tonen de standaardfout van het gemiddelde. Sterretjes geven verschillende P-waarden aan: * P<0,05; ** P<0.005., n.s: niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode voor functionele beoordelingen van BRCA1-varianten met behulp van CRISPR-gemediteerde cytosinebasiseditor. Het protocol beschrijft methoden voor het ontwerp van gRNA's bij doel locus en de constructie van de plasmide DNA's waaruit ze worden uitgedrukt. Cytosinebasiseditors induceren nucleotideconversie in een actief venster (in het geval van BE3, nucleotiden 4–8 in het PAM-distale uiteinde van de gRNA-doelsequenties). De onderzoeker moet zorgvuldig doelsequenties kiezen, omdat alle cytosines in een actief venster kunnen worden vervangen door thymines. Bovendien moeten, zoals beschreven in stap 5, meerdere cytosines in een actief venster zorgvuldig worden geanalyseerd om de functie van BRCA1-varianten te evalueren.
Een van de belangrijkste stappen is transfectie in de doelcellijn, die de initiële mutatiefrequentie voor BRCA1-functionele beoordelingen beïnvloedt. Om de initiële mutatiefrequentie te verbeteren, moeten de onderzoekers de toedieningsmethoden voor de cellijn optimaliseren. Zoals beschreven in stap 1, is de generatie van BE3 die cellijnen uitdrukt een nuttige optie om de initiële mutatiefrequentie te verhogen. We raden niet aan om gRNA in de HAP1-BE3-cellen te gebruiken, omdat constitutieve expressie van BE3 en gRNA accumulatieve nucleotideconversie kan veroorzaken, en deze resultaten interfereren met de functionele beoordeling van BRCA1-varianten.
Naast de bemiddelde METHODEN BE3 die in dit protocol zijn geïntroduceerd, worden verschillende complementaire methoden aanbevolen om de functionele beoordelingen van BRCA1-varianten verder uit te breiden. Ten eerste, zoals hierboven beschreven, is de mutatiefrequentie in het eerste monster belangrijk om betrouwbare resultaten van BRCA1-varianten te verkrijgen. Om de basisbewerkingsefficiëntie te verhogen, worden varianten van cytosine-basiseditors, zoals BE4max, aanbevolen. Ten tweede herkent de BE3 doel-DNA-sequentie via de 5'-NGG-3' PAM-sequenties, wat een beperking is bij het genereren van verschillende soorten BRCA1-varianten. Recent ontwikkelde Cas9-varianten met gewijzigde PAM-sequenties zijn in dit geval een nuttige optie om doelbare BRCA1-varianten 26,27,28uit te breiden . Ten derde induceert de BE3 aanzienlijke basisbewerkingen op ongewenste sites en kan het off-target effect de functionele beoordeling van BRCA1-varianten29,30,31beïnvloeden . Om het off-target effect van BE3 te verminderen, moeten doellocaties van gRNA's zorgvuldig worden gekozen zonder vergelijkbare sequenties in het genoom. SECURE-BE3 of YE1, die is ontwikkeld voor het verminderen van ongewenste basisbewerking in genoom en transcriptoom, zijn nuttige optie32,33. Vooruit, een saturation genome editing (SGE) methode gebaseerd op Cas9-gemedieerde HDR ook geweldige opties voor functionele analyse van BRCA1 varianten19. De methode heeft geen beperking voor het selecteren van doelsequenties en nucleotideposities van BRCA1-varianten. Hdr-gebaseerde aanpak is echter relatief minder efficiënt dan de basiseditors en vereist bovendien ontwerp en synthese van donorsjablonen14. Ten slotte omvatten patiënt afgeleide BRCA1-varianten verschillende reeks mutaties, zoals puntmutaties, invoegingen en deleties. Hiervan zijn puntmutaties de belangrijkste populatie van BRCA1-varianten, die niet alleen C:G naar T:A-conversie zijn, maar ook A:T naar G:C, C:G naar G:C en A:T naar T:A-conversies. Voor functionele beoordelingen van dit soort conversies zijn CRISPR-gemedieerde adenosine basiseditors en Prime Editors waardevolle opties34,35. De snel ontwikkelende genoomtechnologie zal functionele beoordelingen van meer diverse BRCA1-varianten mogelijk maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Research Foundation of Korea (subsidies 2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637 en 2018R1A5A2020732 to Y.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI | NEB | R3136 | Restriction enzyme |
| Blasticidin | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | Drug for selecting transduced cells |
| BsaI | NEB | R0535 | Restriction enzyme |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | Genomic DNA prep. kit |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | 11965092 | Medium for HEK293T/17 cells |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000036 | Supplemetal for cell culture |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection reagent |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | Gibson assembly kit |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium | Gibco | 12440046 | Medium for HAP1 cells |
| lentiCas9-Blast | Addgene | 52962 | Plasmids DNA for lentiBE3 cloning |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | Transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Transfection materials |
| pCMV-BE3 | Addgene | 73021 | Plasmids DNA for lentiBE3 cloning |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | Supplemetal for cell culture |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530SQ | High-fidelity polymerase |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Plasmids DNA for virus prep. |
| pRG2 | Addgene | 104174 | gRNA cloning vector |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmids DNA for virus prep. |
| QIAprep Spin Miniprep kit | Qiagen | 27106 | Plasmid DNA prep. Kit |
| QIAquick Gel extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel extraction kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR product prep. kit |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200 | Ligase for gRNA cloning |
| T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | Materials for T7E1 assay |
| XbaI | NEB | R0145 | Restriction enzyme |
References
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
- Kuchenbaecker, K. B., et al. Risks of Breast, Ovarian, and Contralateral Breast Cancer for BRCA1 and BRCA2 Mutation Carriers. Journal of the American Medical Association. 317 (23), 2402-2416 (2017).
- Millot, G. A., et al. A guide for functional analysis of BRCA1 variants of uncertain significance. Human Mutation. 33 (11), 1526-1537 (2012).
- Santos, C., et al. Pathogenicity evaluation of BRCA1 and BRCA2 unclassified variants identified in Portuguese breast/ovarian cancer families. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (3), 324-334 (2014).
- Starita, L. M., et al. A Multiplex Homology-Directed DNA Repair Assay Reveals the Impact of More Than 1,000 BRCA1 Missense Substitution Variants on Protein Function. American Journal of Human Genetics. 103 (4), 498-508 (2018).
- Anantha, R. W., et al. Functional and mutational landscapes of BRCA1 for homology-directed repair and therapy resistance. Elife. 6, (2017).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A.
- Quann, K., Jing, Y., Rigoutsos, I. Post-transcriptional regulation of BRCA1 through its coding sequence by the miR-15/107 group of miRNAs. Frontiers in Genetics. 6, 242 (2015).
- Saunus, J. M., et al. Posttranscriptional regulation of the breast cancer susceptibility gene BRCA1 by the RNA binding protein HuR. Cancer Research. 68 (22), 9469-9478 (2008).
- Knott1, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361, 866-869 (2018).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Hess, G. T., et al. Directed evolution using dCas9-targeted somatic hypermutation in mammalian cells. Nature Methods. 13 (12), 1036-1042 (2016).
- Kim, K., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos. Nature Biotechnology. 35 (5), 435-437 (2017).
- Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
- Park, D. S., et al. Targeted Base Editing via RNA-Guided Cytidine Deaminases in Xenopus laevis Embryos. Molecules and Cells. 40 (11), 823-827 (2017).
- Kweon, J., et al. A CRISPR-based base-editing screen for the functional assessment of BRCA1 variants. Oncogene. 39 (1), 30-35 (2020).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Findlay, G. M., et al. Accurate classification of BRCA1 variants with saturation genome editing. Nature. 562 (7726), 217-222 (2018).
- Kweon, J., Kim, D. E., Jang, A. H., Kim, Y. CRISPR/Cas-based customization of pooled CRISPR libraries. PLoS One. 13 (6), 0199473 (2018).
- Kim, Y., et al. A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. Nature Biotechnology. 31 (3), 251-258 (2013).
- Sayers, E. W., et al.
- Hwang, G. H., et al. Web-based design and analysis tools for CRISPR base editing. BMC Bioinformatics. 19 (1), 542 (2018).
- Kim, D., Kim, D. E., Lee, G., Cho, S. I., Kim, J. S. Genome-wide target specificity of CRISPR RNA-guided adenine base editors. Nature Biotechnology. 37 (4), 430-435 (2019).
- Clement, K., et al. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nature Biotechnology. 37 (3), 224-226 (2019).
- Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
- Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
- Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. , (2020).
- Kim, D., et al. Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases. Nature Biotechnology. 35 (5), 475-480 (2017).
- Zuo, E., et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science. 364 (6437), 289-292 (2019).
- Jin, S., et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science. 364 (6437), 292-295 (2019).
- Grunewald, J., et al. Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature. 569 (7756), 433-437 (2019).
- Doman, J. L., Raguram, A., Newby, G. A., Liu, D. R. Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors. Nature Biotechnology. 38 (5), 620-628 (2020).
- Gaudelli, N. M., et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 551 (7681), 464-471 (2017).
- Anzalone, A. V., et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).
